郎慧玲　劉晟男　錢甜甜　曹玓　王鈺粟　于佳琪　趙忠新　劉丹

[摘要] 目的 探討染料木黃酮（Genistein，Gen）阻滯結腸癌細胞S期向G2/M期轉換與JNK通路的關系。 方法 以人結腸癌SW620細胞為研究對象，實驗分三個系列組，第一系列組為對照組和SP600125組（10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L），第二系列為對照組、Gen組（20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）和聯(lián)用組（Gen 40 μmol/L和SP600125 40 μmol/L），第三系列為對照組、Gen組（40 μmol/L）、SP600125組（40 μmol/L）和聯(lián)用組。蛋白質印跡法篩選SP600125的最適工作濃度及Cyclin B1、P-Cdc2和Cdc2蛋白的表達。MTS法檢測細胞增殖。 結果 SP600125的最適工作濃度為40 μmol/L。藥物組的Cyclin B1（除Gen 20 μmol/L組）、P-Cdc2和Cdc2蛋白表達均顯著下調（P<0.01），Cyclin B1蛋白表達隨Gen劑量的增加而降低（P<0.01），聯(lián)用組Cyclin B1明顯低于Gen 40 μmol/L組（P<0.01），聯(lián)用組P-Cdc2和Cdc2蛋白與Gen 40 μmol/L組的比較雖有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。抑制JNK通路可增強Gen抗SW620細胞增殖的作用。 結論 抑制JNK通路可通過減少結腸癌SW620細胞Cyclin B1-Cdc2的活化，阻滯細胞由S期進入G2/M期。

[關鍵詞] 染料木黃酮;JNK;結腸癌;細胞周期

[中圖分類號] R329? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）34-0026-05

Effect of inhibition of JNK pathway on Genistein-induced colon cancer SW620 cell cycle arrest

LANG Huiling1? ?LIU Shengnan1? ?QIAN Tiantian1? ?CAO Di1? ?WANG Yusu2? ?YU Jiaqi1? ZHAO Zhongxin3? ?LIU Dan1

1.Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China;2.Harbin Medical University， Harbin? ?150081，China;3.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161041，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between genistein（Genstein， Gen）-induced colon cancer cell arrest from S phase into G2/M phase and JNK pathway. Methods Human colon cancer SW620 cells were used as the research object. The cells were divided into three series. The first series were the control group and the SP600125 group （10 μmol/L， 20 μmol/L， 30 μmol/L， 40 μmol/L）. The second series were the control group， the Gen group （20 μmol/L， 40 μmol/L， 80 μmol/L） and the combination group（Gen 40 μmol/L and SP600125 40 μmol/L）. The third series were the control group， the Gen group （40 μmol/L）， the SP600125 group （40 μmol/L） and the combination group. Western blotting was used to screen the optimal working concentration of SP600125 and the expression of Cyclin B1， P-Cdc2 and Cdc2 proteins. Cell proliferation was detected by the MTS method. Results The optimum working concentration of SP600125 was determined as 40 μmol/L. The expression of Cyclin B1（except for Gen 20 μmol/L group）， P-Cdc2 and Cdc2 protein in the drug group was significantly reduced（P<0.01）. The expression of Cyclin B1 protein was decreased with the increase of Gen dose （P<0.01）. The Cyclin B1 of the combination group was significantly lower than that of the Gen 40 μmol/L group （P<0.01）. A decreasing trend of P-Cdc2 and Cdc2 proteins was found in the combination group compared with the Gen 40 μmol/L group， but the difference was statistical insignificant （P>0.05）. The proliferation of Gen anti-SW620 cells was enhanced by the inhibition of JNK pathway. Conclusion Inhibition of JNK pathway can inhibit the activation of Cyclin B1-Cdc2 in colon cancer SW620 cells， block cells in S phase and prevent cells entering into G2/M phase.

[Key words] Genistein; JNK; Colon cancer; Cell cycle

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一。在全球惡性腫瘤中，結直腸癌的發(fā)病率排名第三，死亡率排名第二[1];在中國惡性腫瘤中，結直腸癌的發(fā)病率排名第三，死亡率排名第五[2]。因此，結直腸癌的防治已成為癌癥防治研究的熱點。目前，腫瘤防治研究的方向聚焦于探索細胞信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路的一個重要家族成員，在細胞增殖、細胞凋亡和細胞應激等多種生理或病理過程中擔任重要角色，在癌癥發(fā)展中同樣起關鍵的調控作用。SP600125是一種JNK通路的強效抑制劑，可以抑制JNK活化，即抑制JNK磷酸化，發(fā)揮抑制JNK信號通路的作用。有研究證實，雌激素治療可降低結直腸癌發(fā)病風險[3-5]。染料木黃酮（Genistein，Gen）是一種具有雌激素活性的天然物質，具有抗腫瘤功效。課題組前期研究[6]結果顯示，抑制JNK通路能增強Gen誘導結腸癌SW620細胞S期阻滯作用，且S期細胞的增多主要源于G2/M期細胞的減少，因此本研究著眼于驅動G2/M期的關鍵因素——Cyclin B1-Cdc2復合物的活性，探討上述S期細胞向G2/M期的轉換受阻與該復合物活性的關系。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源

人結腸癌SW620細胞由哈爾濱醫(yī)科大學遺傳學研究室饋贈。Gen（批號：G6649-25 mg）和DMSO（批號：D5879-100 mL）為Sigma公司生產。RPMI 1640培養(yǎng)液（貨號：SH30027.01，批號：AYA52774）為Hyclone公司生產。胎牛血清（貨號：11011-8611， 批號：2017 0713）為杭州四季青公司生產。胰蛋白酶（批號：0458-25g）為Amresco公司生產。MTS（貨號：G3582， 批號：0000044688）為Promega公司生產。SP600125（貨號：sc-200635，批號：A2714）為Santa Cruz公司生產。T-JNK（JNK1/2/3）多克隆抗體（貨號：YT2439，批號：B3901）、P-JNK（T183/Y185）多克隆抗體（貨號：YP0157，批號：B6701）、Cdc2（Y15）多克隆抗體（貨號：YT0789，批號：B8901）、P-Cdc2（T161）多克隆抗體（貨號：YP0053，批號：B5301）和Cyclin B1多克隆抗體（貨號：YT1169，批號：B6901）為Immunoway公司生產。β-actin多克隆抗體（貨號：BA2305，批號：12cm81）為武漢博士德生物公司生產。辣根酶標記山羊抗兔IgG（貨號：CW0103，批號：00111408）、哺乳動物蛋白抽提試劑盒（貨號：CW08895，批號：50201）和BCA蛋白定量試劑盒（貨號：CW0014，批號：00021303）為北京康為世紀生物公司生產，蛋白Marker（貨號：26616-SM0671）為MBI公司生產，ECL超敏發(fā)光液（貨號：P1010，批號：171206）為北京普利萊公司生產，NC膜為Pall公司生產。

1.2 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo-311）;超凈工作臺;酶標儀（美國BIO-RAD 680）;天能數碼凝膠分析儀（Tanon-5200）;電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-10C）;垂直平板電泳槽（上海天能儀器廠，VE-180A）;轉印槽（上海天能儀器廠，VE-186）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)? SW620細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁至80%左右時，用胰蛋白酶消化，分瓶傳代。實驗分三個系列組，第一系列為SP600125（JNK抑制劑）有效劑量篩選組，分對照組、SP600125 10 μmol/L組、SP600125 20 μmol/L組、SP600125 30 μmol/L組和SP600125 40 μmol/L組;第二系列分對照組、聯(lián)用組（Gen 40 μmol/L和SP600125 40 μmol/L）、Gen組（20 μmol/L）、Gen組（40 μmol/L）和Gen組（80 μmol/L）;第三系列為對照組、Gen組（40 μmol/L）、SP600125組（40 μmol/L）和聯(lián)用組。取狀態(tài)良好的對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 蛋白質印記法篩選JNK抑制劑的最適工作濃度? 細胞以5×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入第一系列不同處理因素的培養(yǎng)液2 mL，處理6 h后，消化細胞，預冷PBS洗滌細胞2次，于冰上加入400 μL的蛋白抽提試劑，用槍頭輕輕吹打細胞，將抽提液轉移至EP管中，冰上裂解30 min，4℃ 14 000 g 離心10 min，小心轉移上清液，并記錄轉移體積，此為抽提的細胞總蛋白。隨后采用BCA 蛋白定量微孔檢測法，將BSA標準品和待測蛋白樣品各25 μL分別加入96孔板，每組設3個復孔，加入200 μL BCA工作液，混勻后，37℃孵育30 min，冷卻至室溫后，于自動酶標儀檢測570 nm的吸光度值，繪制標準曲線，根據曲線計算待測樣品的蛋白濃度，用5×上樣緩沖液和細胞裂解液稀釋，將待測樣品蛋白濃度調整為2 μg/μL。然后100℃加熱5 min，冷卻后混勻，變性后的蛋白樣品于-20℃保存。取各組樣品蛋白30 μg上樣，經SDS-PAGE電泳分離后，轉移至NC膜上，封閉液封閉2 h，TBS洗滌3次，一抗P-JNK（1∶1 000）、T-JNK（1∶1 000）和β-actin（1∶400）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，HRP標記二抗室溫搖床2 h，TBS洗滌2次，TBST洗滌1次，ECL發(fā)光，顯影，定影，用Photoshop13.0軟件分析目的蛋白的相對灰度值的差異。

1.3.3 蛋白質印記法檢測G2/M期相關蛋白的表達? 細胞以5×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入第二系列不同處理因素的培養(yǎng)液2 mL，處理24 h后，收集細胞，抽提細胞蛋白，然后用BCA蛋白定量微孔檢測法進行蛋白定量，調整樣品蛋白濃度為2 μg/μL，樣品蛋白煮沸變性（過程同1.3.2）。取各組樣品蛋白30 μg上樣，經SDS-PAGE電泳分離后，轉移至NC膜上，封閉液封閉2 h，TBS洗滌3次，一抗Cyclin B1（1∶1 000）、P-Cdc2（1∶1 000）、Cdc2（1∶1 000）和β-actin（1∶400）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，HRP標記二抗室溫搖床2 h，TBS洗滌2次，TBST洗滌1次，ECL發(fā)光，于天能數碼凝膠分析儀顯影拍攝，并分析目的蛋白的相對灰度值的差異。

1.3.4 MTS法檢測細胞增殖? 細胞以8×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入第三系列不同處理因素的培養(yǎng)液150 μL，處理24 h后，加入MTS，每孔7.5 μL，繼續(xù)孵育1～2 h，于酶標儀490 nm波長處檢測每孔的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數據采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蛋白質印記法檢測SP600125對SW620細胞JNK通路的抑制作用

SP600125是一種強效的JNK通路抑制劑（圖1）。與對照組相比，SP600125能明顯阻斷絕大部分P-JNK蛋白表達（P<0.01）的最適工作濃度為40 μmol/L。見表1。

2.2 蛋白質印記法檢測Cyclin B1、P-Cdc2（T161）和Cdc2（Y15）蛋白的表達

如圖2所示，與對照組相比，除Gen 20 μmol/L組中的Cyclin B1外，其余藥物組的Cyclin B1、所有藥物組的P-Cdc2和Cdc2蛋白表達均顯著下調（P<0.01），Cyclin B1呈現(xiàn)Gen劑量依賴（P<0.01），且聯(lián)用組Cyclin B1明顯低于Gen 40 μmol/L組（P<0.01）。P-Cdc2和Cdc2蛋白雖無明顯Gen劑量依賴（P>0.05），但P-Cdc2蛋白在Gen 20 μmol/L和40 μmol/L之間有顯著差異（P<0.01），聯(lián)用組P-Cdc2和Cdc2蛋白與Gen 40 μmol/L組比較有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 MTS法檢測不同藥物組對SW620細胞增殖的抑制作用

如圖3所示，與對照組比較，所有藥物組均有明顯抑制SW620細胞增殖的作用（P<0.01），且聯(lián)用組的抗增殖效果比Gen組和抑制劑組強（P<0.01，P<0.05）。見表3。

3 討論

細胞周期分為G1期、S期、G2期和M期（有絲分裂期），只有連續(xù)、精準的細胞周期進程才能實現(xiàn)細胞增殖，因此細胞增殖改變的實質是細胞周期發(fā)生變化。在細胞周期中，細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是調控系統(tǒng)的核心[7]。Cyclin B屬于G2/M期的關鍵細胞周期蛋白，調節(jié)G2期細胞向M期轉換，其合成于S期晚期，M期達高峰，并隨著M期的結束而降解，但其必須與CDK1（Cdc2）結合為成熟促進因子（MPF）的復合物，并當Cdc2第161位的蘇氨酸殘基（T161）磷酸化和第15位的酪氨酸殘基（Y15）去磷酸化時，Cyclin B-Cdc2才被激活[8-10]，發(fā)揮對細胞周期的正向調控作用。與正常細胞和組織相比，Cyclin B1在多種癌癥中過表達，結直腸癌也不例外，有研究證實，88%結直腸癌組織存在Cyclin B1蛋白高表達，并與癌細胞高增殖率一致[11]。Cyclin B1還可以促進結直腸癌的發(fā)生和隨后的淋巴結轉移[12]。Cyclin的合成，與CDK的結合同時受到JNK通路的影響，JNK抑制劑預處理可阻斷Cyclin B1的積累，即JNK失活阻斷了細胞有絲分裂進程，抑制細胞增殖[13]。丙型肝炎病毒（HCV）蛋白通過JNK途徑增加Cyclin B1-Cdc2復合物的活性。二烯丙基三硫醚（DATS）通過激活JNK通路誘導胃癌BGC-823細胞G2/M期阻滯，這與Cyclin A2和Cyclin B1的合成增加有關[14]。

Gen作為一種潛在的抗癌藥物已被應用多年。Gen能通過誘導多種腫瘤細胞發(fā)生G0/G1期、S期和G2/M期阻滯[15-19]，從而抑制癌細胞的增殖。本研究結果顯示，抑制JNK通路能增強Gen下調SW620細胞Cyclin B1、P-Cdc2（T161）和Cdc2（Y15）蛋白表達的作用，其中Cyclin B1的變化最為顯著，且Cyclin B1呈現(xiàn)Gen劑量依賴效應，與課題組前期研究Gen誘導SW620細胞S期阻滯主要源于S期進入G2/M期的細胞減少，且S期阻滯作用隨Gen劑量的增加而增強[6]的結果相符，且抑制JNK通路能增強Gen抑制SW620細胞增殖的作用，這也與S期細胞阻滯作用增強和上調Cyclin B1-Cdc2蛋白的結果一致。但是，P-Cdc2（T161）和Cdc2（Y15）的下調作用并沒有與Cyclin B1一樣有較大幅度的降低，一般來說，Cyclin B1的合成增加可以刺激Cdc2在相應位點發(fā)生磷酸化和去磷酸化，它們并未同步的原因可能與細胞周期的其他調節(jié)機制有關。值得關注的是，負向調控細胞周期的關鍵因子被稱為細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子（CDKI）[7]，該家族蛋白可以抑制Cyclin-CDK復合物的活性，使細胞周期受阻，p53和p21就是最常見的CDKI。另外，細胞周期檢測點可監(jiān)測細胞周期[20]，使之有序進行，當檢測點出現(xiàn)異常時，細胞周期因無法通過檢測點而被停止，如DNA復制不完全、蛋白質合成和積累的不夠充足等。當然，細胞周期還會受到細胞內外環(huán)境多種因素的刺激而發(fā)生變化，因此，細胞周期的調控是一個復雜的綜合系統(tǒng)，細胞在此系統(tǒng)的調控下如何生存或是死亡，尚待進一步的研究。

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（收稿日期：2019-09-17）