急性高溫脅迫對(duì)虹鱒二倍體和三倍體 幼魚hsps基因表達(dá)的影響?

辛苑茹， 溫海深， 李吉方， 侯志帥， 張美昭， 車德釗， 陳落落

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué)), 山東 青島 266003)

魚類屬于變溫動(dòng)物，水溫是影響魚類生長(zhǎng)發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一。虹鱒(Oncorhynchusmykiss)隸屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)大馬哈魚屬(Oncorhynchus)，是全球性養(yǎng)殖的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的冷水性優(yōu)良養(yǎng)殖品種[1]。其最適宜水溫在12～18 ℃之間，當(dāng)季節(jié)改變，尤其是夏季高溫天氣引起水溫升高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致虹鱒在新陳代謝，生長(zhǎng)發(fā)育等方面面臨挑戰(zhàn)。當(dāng)水溫高于20 ℃時(shí)，魚體表現(xiàn)為食欲減退，生長(zhǎng)減緩。當(dāng)水溫高于24 ℃時(shí)，虹鱒停止攝食，長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)高溫則導(dǎo)致虹鱒患病、死亡，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

處于不良環(huán)境時(shí)，有機(jī)體處于脅迫狀態(tài)，此時(shí)有機(jī)體會(huì)通過各個(gè)層次的生理活動(dòng)回應(yīng)不良環(huán)境的刺激，維持生理穩(wěn)態(tài)。在神經(jīng)內(nèi)分泌水平上，嗜鉻細(xì)胞釋放兒茶酚胺類激素，下丘腦-垂體-腎間組織軸釋放糖皮質(zhì)激素(如皮質(zhì)醇)，上述兩類激素共同調(diào)控魚類的初級(jí)脅迫反應(yīng)[3]。在細(xì)胞水平上，細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)發(fā)生合成和表達(dá)的變化從而使機(jī)體表現(xiàn)出一系列行為和生理上的改變，進(jìn)而抵抗不良環(huán)境的刺激[4]。最顯著的特點(diǎn)之一便是熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)表達(dá)的增加[5]。熱休克蛋白也稱為應(yīng)激蛋白(Stress protein)，廣泛存在于生物體中，幫助有機(jī)體應(yīng)對(duì)熱脅迫、滲透壓脅迫、重金屬脅迫、饑餓脅迫、低氧脅迫等各種不良環(huán)境。按照蛋白質(zhì)分子量不同，HSPS可分為分子量較大的HSP70家族、HSP90家族和HSP60家族，以及小分子HSP家族及泛素。許多研究表明，高溫脅迫能夠顯著影響魚類hsps基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。周彥靜提出[6]，虹鱒鰓、中腎、腦、心臟和肌肉中hsp90α表達(dá)量隨水溫的升高呈逐步上升的趨勢(shì)。李珍提出熱應(yīng)激過程中[7]，心臟、腦和肝臟中hsp40、hsp90β的表達(dá)量較高。由于魚類存在基因組的加倍[8]，導(dǎo)致熱休克蛋白在魚類中出現(xiàn)了許多亞型，在魚類中尚不清楚何種熱休克蛋白的亞型為應(yīng)激型[9]。此外，不同亞型的熱休克蛋白面對(duì)應(yīng)激的應(yīng)答幅度也不盡相同。由于hsp70s和hsp90s在虹鱒中具有諸多亞型，探究熱脅迫狀態(tài)下不同hsps亞型普遍的和特異的生理功能，對(duì)了解虹鱒適應(yīng)熱脅迫的生理機(jī)制具有重要的生理意義。

多倍體誘導(dǎo)技術(shù)在魚類育種中得到了廣泛應(yīng)用，人工誘導(dǎo)多倍體也獲得了成功。多倍體魚類具有生長(zhǎng)快、體型大等經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)由于三倍體雌性虹鱒性腺不發(fā)育，即使養(yǎng)殖個(gè)體逃逸到天然水體中，也不會(huì)污染本地基因庫，因此具有極大的推廣價(jià)值[10]。然而，當(dāng)處于生長(zhǎng)的次優(yōu)條件時(shí)，或者與二倍體魚類混養(yǎng)時(shí)，與二倍體魚類相比，三倍體魚類具有較差的抗逆性，表現(xiàn)出較差的生長(zhǎng)狀況，三倍體魚類對(duì)于環(huán)境的要求更加苛刻，三倍體鮭科魚類的抗高溫能力以及抗低氧能力低于同科的二倍體魚類。三倍體魚類的畸形發(fā)生率更高，游動(dòng)能力更差。與二倍體魚類混養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)出較低的攻擊性。[11]。Biron and Benfey曾研究表明[12]，二倍體和三倍體鮭科魚類面對(duì)應(yīng)激，在神經(jīng)內(nèi)分泌水平上無顯著差異。然而，三倍體鮭科魚在細(xì)胞層次上的應(yīng)答水平尚無相關(guān)研究。由于三倍體魚類遺傳物質(zhì)的增加，導(dǎo)致魚類細(xì)胞核和細(xì)胞的體積增加，表面積比與體積比減小，這可能會(huì)導(dǎo)致一些分子進(jìn)出入細(xì)胞的能力降低，因此改變了細(xì)胞面對(duì)應(yīng)激時(shí)的應(yīng)對(duì)水平。

在全球變暖的大背景下，黃海北部海域的水溫波動(dòng)劇烈，對(duì)于魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。本研究的目的是對(duì)比二倍體和三倍體虹鱒幼魚在應(yīng)對(duì)48h熱應(yīng)激和48h恢復(fù)期過程中不同hsp70和hsp90基因亞型mRNA的表達(dá)變化。本研究期望探究二倍體和三倍體魚類之間潛在的抗逆性能差異，為三倍體虹鱒的人工養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2018年6月，于山東省濰坊市臨朐縣寺頭鎮(zhèn)洛莊村臨朐鮭鱒漁業(yè)發(fā)展有限公司進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用三倍體虹鱒200尾(體長(zhǎng)(4.764±0.099) cm，體重(1.74±0.055) g)，二倍體虹鱒200尾(體長(zhǎng)(4.428±0.131) g，體重(1.582±0.035) g)，二倍體和三倍體所用魚在規(guī)格上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，所有實(shí)驗(yàn)用魚健康、活潑，并且為同一批次孵化。實(shí)驗(yàn)魚在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)期間全循環(huán)流水，連續(xù)充氣，pH為6.6～7.0，溶氧(DO)>6 mg/L。

實(shí)驗(yàn)用試劑主要有，RNAiso Reagent 試劑、Taq 酶、DNaseⅠ (RNasefree)、RNasin、RNA 酶和 SYBR Premix Ex Taq 均購自 TaKaRa 公司，表達(dá)所需的引物均由華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集 實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組和2個(gè)處理組，對(duì)照組分別為二倍體對(duì)照組和三倍體對(duì)照組，處理組為二倍體處理組和三倍體處理組。2個(gè)對(duì)照組的幼魚在96 h的實(shí)驗(yàn)全程中置于14 ℃水體中，2個(gè)處理組幼魚在22 ℃水體中熱應(yīng)激48 h后，放入14 ℃水體中恢復(fù)48 h。每組水溫誤差在1 ℃以內(nèi)。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放入20尾魚。在實(shí)驗(yàn)開始的第0、6、24、48、72和96 h對(duì)4個(gè)組別的虹鱒幼魚進(jìn)行采樣。每個(gè)組每次采樣3尾實(shí)驗(yàn)魚。

采樣前將實(shí)驗(yàn)魚放入MS-222麻醉劑(40～45 g/L)中麻醉，以減少采樣操作對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，實(shí)驗(yàn)魚無掙扎之后迅速解剖肝臟和肌肉組織，液氮中速凍然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 按照TRIzol試劑盒的操作手冊(cè)使用TRIzol試劑對(duì)樣品中的總RNA進(jìn)行提取，所有試驗(yàn)過程嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防RNA 污染。對(duì)總RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)后視情況對(duì)RNA進(jìn)行稀釋，并利用takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及目的基因的定量測(cè)定 根據(jù)Ojima等[13]的研究成果合成hsp70a、hsp70b的引物序列。hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b、hsp90b1、hsp90b2引物序列由NCBI上所發(fā)表的根據(jù)Garcia de la serrana和Johnston[14]所研究的大西洋鮭hsp DNA序列所定位出的虹鱒cDNA序列和β-actin基因序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如下。送交華大基因合成。引物序列及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度如表1所示。

對(duì)樣品 cDNA 進(jìn)行 4 倍梯度稀釋，以稀釋后的cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR，每個(gè)模板設(shè) 3 個(gè)平行。PCR 反應(yīng)體系 (共 20 μL): SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，模板 2μL，ddH2O 6 μL，ROX reference dye (50×)0.4 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃下預(yù)變性30 s，95 ℃下變性5 s，相應(yīng)基因退火溫度下退火30 s，75 ℃下延伸 30 s，共進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)連續(xù)測(cè)定擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的熒光，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)樣品中的 cDNA 進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立一致，每個(gè)樣品設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的結(jié)果，以β-actin 為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因以及β-actin的 Ct值計(jì)算出ΔCt數(shù)值，再根據(jù)對(duì)照組目的基因以及β-actin的 Ct值計(jì)算出ΔΔCt數(shù)值，按照 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SEM)表達(dá)。采用SPSS 19. 0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。使用GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

表 1 虹鱒 hsps家族和 β-actin基因表達(dá)所用引物Table 1 Primers used in gene expression of hsps and β-actin genes in rainbow trout

2 結(jié)果

2.1 熱脅迫期間，肝臟與肌肉hsp70a、hsp70b基因的相對(duì)表達(dá)

熱脅迫期間，不同倍性虹鱒肝臟與肌肉hsp70a、hsp70b基因的相對(duì)表達(dá)如圖1所示。二倍體、三倍體虹鱒肝臟與肌肉hsp70a基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6h后均顯著升高(P<0.05)至峰值，在熱脅迫48 h后，二倍體虹鱒肝臟hsp70a基因的相對(duì)表達(dá)恢復(fù)到基底水平，與熱脅迫前無顯著差異(P>0.05，見圖1A)。二倍體虹鱒肌肉、三倍體虹鱒肝臟與肌肉的hsp70a基因相對(duì)表達(dá)在熱脅迫72 h后恢復(fù)，與熱脅迫前(0 h)無顯著差異(P>0.05，見圖1A)。

二倍體、三倍體虹鱒肝臟與肌肉hsp70b基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后顯著升高(P<0.05)，在熱脅迫48 h后顯著下降，與熱脅迫前(0 h)無顯著差異(P>0.05，見圖1B)。二倍體虹鱒肝臟、三倍體虹鱒肝臟與肌肉hsp70b基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后達(dá)到峰值，而二倍體虹鱒肌肉的hsp70b基因相對(duì)表達(dá)量在熱脅迫24 h后達(dá)到峰值(見圖1B)。

2.2 熱脅迫期間，肝臟與肌肉hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b和hsp90b2基因的相對(duì)表達(dá)

熱脅迫期間，不同倍性虹鱒肝臟與肌肉hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b、hsp90b1和hsp90b2基因的相對(duì)表達(dá)如圖2所示。二倍體、三倍體虹鱒肝臟與肌肉hsp90a1a基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后均顯著升高(P<0.05)，在熱脅迫48 h后顯著下降，二倍體、三倍體虹鱒肝臟與肌肉hsp90a1a基因的相對(duì)表達(dá)在72 h恢復(fù)到基底水平，與熱脅迫前無顯著差異(P>0.05，見圖2A)。二倍體虹鱒肝臟與肌肉、三倍體虹鱒肌肉hsp90a1a基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后達(dá)到峰值，而三倍體虹鱒肝臟的hsp90a1a基因相對(duì)表達(dá)量在熱脅迫24 h后達(dá)到峰值(見圖2A)。

(圖中不同字母表示同一組織不同時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異(P< 0.05，單因素方差分析與Duncan’s多重比較)。Different letters in one sample time indicate significant differences within same tissue (P<0.05, one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple range test).)

圖1 急性高溫脅迫對(duì)二倍體、三倍體虹鱒幼魚肝臟和 肌肉hsp70smRNA表達(dá)水平的影響(n=3)
Fig.1 Effect of high temperature on hepatic and musclehsp70smRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout (n=3)

二倍體、三倍體虹鱒肝臟和肌肉hsp90a1b基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后顯著升高(P<0.05)，在熱脅迫48 h后，開始下降。二倍體虹鱒肝臟與肌肉、三倍體虹鱒肌肉hsp90a1b基因的相對(duì)表達(dá)量在熱脅迫24 h后達(dá)到峰值，而三倍體虹鱒肝臟hsp90a1b基因的相對(duì)表達(dá)量在6h后達(dá)到峰值。在熱脅迫48 h后，二倍體和三倍體虹鱒肝臟hsp90a1b基因的相對(duì)表達(dá)恢復(fù)至熱脅迫前水平(P>0.05，見圖2B)。而二倍體和三倍體虹鱒肌肉hsp90a1b基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫72 h后才恢復(fù)至基底水平(見圖2B)。

二倍體、三倍體鱒肝臟與肌肉hsp90a2a基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后均顯著升高(P<0.05)至峰值，在熱脅迫48 h后開始下降。二倍體虹鱒肝臟和三倍體虹鱒肌肉hsp90a2a基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫48 h后恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)開始前水平(P>0.05，見圖2C)。而二倍體虹鱒肌肉和三倍體虹鱒肝臟hsp90a2a基因相對(duì)表達(dá)量在72 h后才回復(fù)至基底水平(見圖2C)。

(圖中不同字母表示同一組織不同時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異(P< 0.05，單因素方差分析與Duncan’s多重比較)。Different letters in one sample time indicate significant differences within same tissue (P<0.05, one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple Range test).)

圖2 急性高溫脅迫對(duì)二倍體、三倍體虹鱒幼魚肝臟和 肌肉hsp90a家族 mRNA表達(dá)水平的影響(n=3)
Fig.2 Effect of high temperature on hepatic and musclehsp90amRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout(n=3)

二倍體、三倍體鱒肝臟與肌肉hsp90a2b基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后均顯著升高(P<0.05)至峰值，在熱脅迫24 h后開始下降。三倍體虹鱒肌肉在熱脅迫24 h后hsp90a2b基因相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)到實(shí)驗(yàn)前水平，而三倍體虹鱒肝臟，二倍體虹鱒肌肉，二倍體虹鱒肝臟分別在在熱脅迫48、72和96 h后hsp90a2b基因相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)到實(shí)驗(yàn)前水平(P>0.05，見圖2D)。

(圖中不同字母表示同一組織不同時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異(P< 0.05，單因素方差分析與Duncan’s多重比較)。Different letters in one sample time indicate significant differences within same tissue (P<0.05, one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple Range test).)

圖3 急性高溫脅迫對(duì)二倍體、三倍體虹鱒幼魚肝臟和 肌肉hsp90b家族mRNA表達(dá)水平的影響(n=3)
Fig.3 Effect of high temperature on hepatic and musclehsp90bmRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout (n=3)

二倍體虹鱒肝臟hsp90b1基因相對(duì)表達(dá)量在熱脅迫6 h后顯著上升并且達(dá)到峰值(P<0.05)，隨后開始下降，在熱脅迫72 h后表達(dá)量降低到實(shí)驗(yàn)開始前的水平(P>0.05，見圖2E)。三倍體虹鱒肝臟hsp90b1基因相對(duì)表達(dá)量在24 h達(dá)到最高水平，隨后逐漸下降，在96 h降低回實(shí)驗(yàn)開始前水平。二倍體、三倍體虹鱒肌肉組織中hsp90b1基因的表達(dá)量在第6 h升高，但二倍體幼魚增加量不顯著，隨后在第24 h降低至實(shí)驗(yàn)前水平，二倍體、三倍性虹鱒肌肉中hsp90b1表達(dá)量分別又在72和48 h時(shí)再次升高，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沒有恢復(fù)到脅迫前水平(P>0.05，見圖3A)。

二倍體、三倍體虹鱒肝臟和肌肉hsp90b2基因相對(duì)表達(dá)量在熱脅迫6 h后顯著升高(P<0.05)，在熱脅迫48 h后顯著下降與熱脅迫前(0 h)無顯著差異(P>0.05，見圖2F)二倍體虹鱒肌肉、三倍體虹鱒肝臟與肌肉hsp90b2基因的相對(duì)表達(dá)在熱脅迫6 h后達(dá)到峰值，而二倍體虹鱒肝臟的hsp90b2基因相對(duì)表達(dá)量在熱脅迫24 h后達(dá)到峰值(見圖3B)。

由此可見，盡管hsp70s和hsp90s的各個(gè)成員均能對(duì)高溫脅迫做出反應(yīng)，但各個(gè)基因亞型具有組織特異性和時(shí)間特異性，且各個(gè)基因的應(yīng)答幅度也不盡相同。

2.3 熱脅迫期間，二倍體、三倍體虹鱒hsp70s、 hsp90s基因的相對(duì)表達(dá)

在熱脅迫開始48 h時(shí)間內(nèi)，二倍體、三倍體虹鱒幼魚均有游動(dòng)失去平衡的情況出現(xiàn)。在熱脅迫實(shí)驗(yàn)過程中，二倍體、三倍體處理組均無死亡現(xiàn)象。

由圖4可知，在熱脅迫開始之前(0 h)，二倍體、三倍體虹鱒幼魚hsps的基礎(chǔ)表達(dá)量無顯著差異(P<0.05)，表達(dá)量很低或基本不表達(dá)。熱脅迫后，二倍體、三倍體虹鱒的肝臟和肌肉組織hsp70s、hsp90s基因的相對(duì)表達(dá)量具有相同的變化趨勢(shì)。在hsps相對(duì)表達(dá)量的峰值的時(shí)間點(diǎn)，即熱脅迫開始后6和24 h，三倍體虹鱒hsps基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于二倍體虹鱒hsps基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

3 討論

魚類屬于變溫動(dòng)物，因此水溫是影響魚類生長(zhǎng)發(fā)育最重要的因素之一。虹鱒屬于冷水性魚類，最適水溫為12～18 ℃，在較大水體，溶氧豐富的情況下可忍受24 ℃的溫度[1]?；诖诉M(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置14(對(duì)照組)、18、22和26 ℃ 4個(gè)水平進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理組放魚30尾，記錄每一組魚類的生理情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)26 ℃處理下的虹鱒幼魚在48 h之內(nèi)有50%以上個(gè)體出現(xiàn)平衡或鰓蓋停止運(yùn)動(dòng)情況出現(xiàn)。因此在正式試驗(yàn)中選擇22 ℃作為高溫處理的溫度，以便于在48 h之后將水溫恢復(fù)到14 ℃魚體能夠恢復(fù)正常游動(dòng)。

本文首次在高溫脅迫下，對(duì)hsp70s和hsp90s基因各個(gè)亞型在二倍體、三倍體虹鱒肝臟和肌肉中的表達(dá)量進(jìn)行了定量測(cè)定。本研究中，hsp70s和hsp90s家族的8個(gè)基因亞型在熱脅迫后表達(dá)量均顯著增加。其他硬骨魚的研究也發(fā)現(xiàn)，熱脅迫導(dǎo)致hsp70a和hsp70bmRNA轉(zhuǎn)錄水平和其蛋白表達(dá)水平的增高。本文對(duì)hsp70a和hsp70bmRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行直接比較，在虹鱒幼魚的肝臟組織中，hsp70a基因的相對(duì)表達(dá)量最高升高了198.22倍，hsp70b基因的相對(duì)表達(dá)量升高了297.88倍，暗示hsp70b基因?qū)崦{迫更為敏感，與Ojima等[13]使用虹鱒RTG-2(虹鱒性腺細(xì)胞系)細(xì)胞的結(jié)果一致。相比于hsp70s2個(gè)亞型，hsp90s具有更多亞型，在本研究中觀察到了全部6個(gè)亞型的表達(dá)水平的改變。其中二倍體幼魚肝臟表達(dá)量增加倍數(shù)由多到少分別為：hsp90a2a(2036.58倍)、hsp90a2b(396.67倍)、hsp90b2(24.17倍)、hsp90a1b(16.97倍)、hsp90a1a(11.89倍)；而在二倍體虹鱒幼魚肝臟組織中hsp90b1 mRNA水平?jīng)]有顯著升高。三倍體幼魚肝臟表達(dá)量倍數(shù)由多到少分別為：hsp90a2a(3 188.07倍)、hsp90a2b(1 823.26倍)、hsp90a1b(753.52倍)、hsp90b2(357.07倍)、hsp90a1a(34.12倍)、hsp90b1(3.59倍)。前人研究證實(shí)虹鱒成魚hspsmRNA的表達(dá)水平與日齡相關(guān)，Basu等[15]認(rèn)為隨虹鱒生長(zhǎng)發(fā)育，應(yīng)激反應(yīng)有所降低?；谝陨辖Y(jié)論，我們推測(cè)虹鱒對(duì)急性高溫脅迫作出反應(yīng)的主要hsps家族是hsp70(hsp70a、hsp70b)和hsp90家族的兩個(gè)成員(hsp90a2a、hsp90a2b)。同樣的結(jié)果也在高溫處理后的斑馬魚(Daniorerio)[16]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[17]、大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[18]中被觀察到。并且在我們的實(shí)驗(yàn)中，hsp90s(hsp90a2a、hsp90a2b)家族mRNA應(yīng)答水平高于hsp70s和hsp90s的其他亞型。

(圖中相同字母不同大小寫表示不同組織同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異(P<0.05，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))。Diffenent capital letters indicate significant differnces at same time point of the same tissue of diploid and triploid juvenile fish ( followed by indenpent t-test).)

圖4 急性高溫脅迫對(duì)二倍體、三倍體虹鱒幼魚肝臟和肌肉hspsmRNA表達(dá)水平的影響(n=3)
Fig.4 Effect of high temperatur on hepatic and musclehspsmRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout (n=3)

在虹鱒二倍體幼魚肌肉組織中，高溫脅迫后hsp70b表達(dá)顯著升高548.80倍，hsp70a基因表達(dá)顯著升高895.72倍；并且hsp90s6個(gè)亞型在肌肉組織中應(yīng)答幅度也不盡相同，分別為：hsp90a2a(550.75倍)、hsp90a2b(236.40倍)、hp90a1b(150.56倍)、hsp90a1a(60.97倍)、hsp90b1(5.64倍)，而在二倍體幼魚肌肉組織中hsp90b2 mRNA水平?jīng)]有顯著升高。在虹鱒三倍體幼魚肌肉組織中，高溫脅迫后hsp70b表達(dá)顯著升高383.97倍，hsp70a基因表達(dá)顯著增高8524.33倍；并且hsp90s6個(gè)亞型應(yīng)答幅度也各有差異，分別為：hsp90a2a(2 655.96倍)、hsp90a1b(1 263.69倍)、hsp90a2b(674.22倍)、hsp90a1a(218.79倍)、hsp90b2(61.88倍)、hsp90b1(21.74倍)。因此我們推測(cè)對(duì)熱脅迫作出反應(yīng)的主要hsps家族是hsp70(hsp70a、hsp70b)和hsp90家族的4個(gè)成員(hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b)，并且hsp70smRNA應(yīng)答水平高于hsp90s。

HSPs是有機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下重要的應(yīng)激蛋白之一，hsps基因在生物體穩(wěn)態(tài)時(shí)表達(dá)量較低或不表達(dá)。當(dāng)有機(jī)體遭遇外界不良環(huán)境刺激時(shí)，機(jī)體增強(qiáng)hsps的轉(zhuǎn)錄與翻譯。HSPs的生物學(xué)功能十分廣泛，不僅能夠維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，拯救或降解環(huán)境刺激導(dǎo)致的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，在未折疊多肽鏈的折疊，蛋白質(zhì)組裝及運(yùn)輸，蛋白質(zhì)的加工和降解等各方面都起到了至關(guān)重要的作用，由于本身不參與大分子蛋白質(zhì)的組成而只起到調(diào)節(jié)活性的作用，因此被稱為“分子伴侶(Molecular Chaperone)”[19]。HSP70家族分為HSP70, HSC70, GRP78和GRP75[20]。其中hsp70為誘導(dǎo)型，即在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量很少，但在應(yīng)激源刺激下則大量表達(dá)。由于hsp70基因沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄過程初始便可以快速合成hsp70蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn)hsp70b也無內(nèi)含子[21]，為熱誘導(dǎo)表達(dá)，基礎(chǔ)表達(dá)量很低。在正常情況下hsp呈現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，hsp70smRNA的半衰期僅有20 min左右，而在應(yīng)激狀態(tài)下，hsp70smRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，半衰期可延長(zhǎng)至4h。因此我們推測(cè)在熱應(yīng)激環(huán)境中，有機(jī)體通過增強(qiáng)hsp70s的轉(zhuǎn)錄和延長(zhǎng)hsp70s的半衰期，維持hsp70s的高表達(dá)水平。

不同內(nèi)、外環(huán)境因素對(duì)有機(jī)體的hsp90a和hsp90b表達(dá)水平的影響不同。hsp90a更容易受到溫度誘導(dǎo)，而hsp90b主要受有絲分裂影響，與細(xì)胞分化和細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)[22]。虹鱒hsp90b1基因在熱脅迫后48 h表達(dá)水平顯著上升，與其他基因變化趨勢(shì)不同。我們推測(cè)虹鱒幼魚在前48 h處于一個(gè)高于最適水溫的環(huán)境中，處于脅迫狀態(tài)，機(jī)體迅速產(chǎn)生hsps保護(hù)機(jī)體免受損傷，提高細(xì)胞對(duì)熱環(huán)境的耐受力。然而在48 h后，將水溫降至14 ℃，雖然此時(shí)水溫是虹鱒的最適生長(zhǎng)水溫，但是溫度的突然變化仍可視作對(duì)有機(jī)體的脅迫，因此hsp水平在水溫發(fā)生降低之后仍有一個(gè)小的上漲。在對(duì)幾種抗氧化酶即超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)的酶活性測(cè)定過程中，也發(fā)現(xiàn)了在48 h時(shí)酶活性的上升此種類似的現(xiàn)象，表明hsps的mRNA表達(dá)增高與幾類抗氧化酶水平的增高是相一致的。激素和酶活性的變化往往發(fā)生在瞬間，不能作為可靠的應(yīng)激指標(biāo)，將hsp的mRNA表達(dá)水平作為動(dòng)物應(yīng)激水平和體質(zhì)健康的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)更為準(zhǔn)確。

本研究的目的之一是對(duì)比二倍體、三倍體虹鱒幼魚對(duì)溫度脅迫是否有分子響應(yīng)水平的差異，未受脅迫的正常生理狀態(tài)下，二倍體、三倍體幼魚的紅細(xì)胞比容(Hct)在許多物種中無顯著差異，皮質(zhì)醇，抗氧化酶，葡萄糖等水平也無顯著差異[23]。本研究中，二倍體、三倍體幼魚hsps各個(gè)基因的基礎(chǔ)表達(dá)量無顯著差異，與生理生化指標(biāo)所顯示的結(jié)果相類似。在應(yīng)激過程中，三倍體虹鱒hsps的mRNA表達(dá)的峰值顯著性高于二倍體虹鱒。我們推測(cè)熱應(yīng)激后，虹鱒肝臟和肌肉細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成受到影響，大量的蛋白質(zhì)因熱脅迫而錯(cuò)誤折疊，無法行駛正常的生理功能。此外，大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)會(huì)在細(xì)胞(特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中)中累積，進(jìn)一步引起細(xì)胞的氧化損傷，并大量積累活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。已知HSPs作為分子伴侶，可以拯救錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，或是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)(ER-associated degradation)[24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱脅迫后三倍體虹鱒hsps的mRNA表達(dá)水平更高，暗示三倍體虹鱒可以通過HSPs拯救錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)折疊，降低細(xì)胞的氧化損傷。與我們的結(jié)果一致，Su[25]認(rèn)為HSP70能提高抗氧化酶類的活性，進(jìn)而消除游離的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

在整個(gè)熱脅迫的過程中，二倍體、三倍體實(shí)驗(yàn)組魚類都沒有出現(xiàn)死亡問題，這一結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所選取的高溫沒有超過虹鱒的耐受限度，仍在其可以調(diào)節(jié)的范圍之內(nèi)。Kazumi等[26]認(rèn)為，機(jī)體hsp70表達(dá)較高時(shí)，機(jī)體具有更強(qiáng)的應(yīng)激能力，可以適應(yīng)較大范圍的溫差變化。在醫(yī)學(xué)研究中，Li等提出HSP與蛋白質(zhì)的折疊，激活，轉(zhuǎn)運(yùn)與降解有關(guān)[27]。有研究認(rèn)為HSP的功能不僅局限于改正錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，還參與激活某些提供保護(hù)機(jī)制的關(guān)鍵蛋白，并幫助這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到靶位點(diǎn)，例如HSP可以穩(wěn)定重要的免疫識(shí)別蛋白NLRs (Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors)，提高有機(jī)體的非獲得性免疫系統(tǒng)功能[28]。本實(shí)驗(yàn)中三倍體虹鱒HSP的升高可以拯救錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和消除游離的氧化自由基，為機(jī)體提供保護(hù)。

4 結(jié)語

本研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒幼魚hsp70s和hsp90s的各成員均能對(duì)高溫脅迫做出反應(yīng)，但各基因亞型具有組織特異性和時(shí)間特異性，且各個(gè)基因的應(yīng)答幅度也不盡相同。熱應(yīng)激6～24 h，三倍體幼魚肝臟和肌肉組織hsps的表達(dá)水平均顯著高于二倍體幼魚組織。表明三倍體虹鱒受到熱脅迫后，肌肉和肝臟細(xì)胞可以大量合成HSPs，拯救或清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)，維持蛋白質(zhì)正常的生理功能，保護(hù)細(xì)胞免受蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊而產(chǎn)生的氧化損傷、死亡。三倍體能夠通過更高的hsp表達(dá)，抵抗環(huán)境脅迫。