體素內(nèi)不相干運動DWI評估SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型腫瘤微環(huán)境乏氧狀態(tài)

徐 曼，余永強，侯唯姝，潘紅利

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，安徽 合肥 230022)

膠質(zhì)瘤是一種瘤內(nèi)微血管高度增生的原發(fā)性腦腫瘤，呈浸潤性生長，高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)[1]。目前對于膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為手術(shù)聯(lián)合放化療[2-3]，但患者預(yù)后較差[4]，膠質(zhì)瘤微環(huán)境呈乏氧狀態(tài)是影響療效的主要因素[5-6]。既往主要采用檢測氧分壓、PET等評估膠質(zhì)瘤微環(huán)境的乏氧程度，但氧分壓檢測為有創(chuàng)性檢查，PET具有輻射，且二者均不能動態(tài)評估乏氧狀態(tài)。體素內(nèi)不相干運動DWI(intravoxel incoherent motion-DWI， IVIM-DWI)采用多個b值獲取系列DWI，可區(qū)分水分子擴散與血液灌注信息，反映活體內(nèi)的微觀運動。本研究探討IVIM-DWI評估SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型腫瘤微環(huán)境乏氧狀態(tài)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號：scxk(皖)2017-001]。本研究經(jīng)我院動物倫理委員會論證并通過。

1.2 膠質(zhì)瘤模型建立 對體外培養(yǎng)處于80%對數(shù)生長期的大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞進(jìn)行消化，制備濃度為108/ml～1010/ml的細(xì)胞懸液備用。將SD大鼠麻醉后保定于定位儀，暴露術(shù)區(qū)顱骨，以冠狀縫前1 mm、矢狀縫右3 mm為鉆孔點鉆開顱骨。采用微量注射器抽取C6細(xì)胞懸液10 μl，自鉆孔點進(jìn)針至硬腦膜下6 mm時后退1 mm，將細(xì)胞懸液緩慢注入大鼠腦實質(zhì)，注射速度約1 μl/min，注射完畢停留5 min，拔針。封閉顱骨鉆孔，縫合切口，待大鼠蘇醒后送回動物房飼養(yǎng)。

1.3 儀器與方法 采用GE Discovery MR750W 3.0T MR 掃描儀，4通道實驗動物專用線圈。在造模第14、21及28天分別取大鼠16只，對其行頭部掃描，采集常規(guī)MRI及IVIM-DWI。FSE T1WI：FOV 6 cm×6 cm，矩陣256×256，層厚2 mm，間距0.5 mm，TR 2 532.1 ms，TE 24 ms； FSE T2WI：FOV 6 cm×6 cm，矩陣256×256，層厚2 mm，間距0.5 mm，TR 4 746 ms，TE 120 ms。IVIM-DWI：FOV 6 cm×6 cm，矩陣128×128，層厚2.4 mm，NEX 4，TR 3 000 ms，TE 102.4 ms，F(xiàn)A 90°，擴散敏感系數(shù)b值分別取0、10、20、50、100、200、400、600、800 s/mm2。

1.4 圖像分析 由2名影像科主治醫(yī)師閱片，意見不同時經(jīng)協(xié)商達(dá)成一致。采用GE ADW 4.6工作站提供的MADC軟件對IVIM-DWI(圖1)進(jìn)行后處理，在腫瘤實性成分最明顯的連續(xù)3個層面上勾畫ROI，避開出血及壞死區(qū)域，獲得參數(shù)ADC、純擴散系數(shù)(D)、偽灌注擴散系數(shù)(D*)及灌注分?jǐn)?shù)(f)。

1.5 病理分析 每次MR掃描后處死大鼠，以4%甲醛溶液灌注心臟后取膠質(zhì)瘤組織，石蠟包埋后切片，行HE染色及缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α)免疫組織化學(xué)染色(圖2)。

圖1 造模不同時間SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型頭部IVIM-DWI偽彩圖 A～D.分別為造模第14天時ADC(A)、D(B)、D*(C)、f(D)偽彩圖； E～H.分別為造模第21天時ADC(E)、D(F)、D*(G)、f(H)偽彩圖； I～L.分別為造模第28天時ADC(I)、D(J)、D*(K)、f(L)偽彩圖

時間ADC(×10-4 mm2/s)D(×10-4 mm2/s)D*(×10-3 mm2/s)fHIF-1α評分第14天3.07±1.354.41±1.094.90±1.310.38±0.081.38±2.09第21天4.28±1.13*8.08±0.87*3.07±1.00*0.49±0.07*5.94±3.73*第28天4.60±1.11*8.27±1.10*4.80±1.52#0.26±0.09*#4.00±2.00*#F值6.7271.5910.0835.6211.28P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：與第14天比較，P<0.05；#：與第21天比較，P<0.05

圖2 SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型腫瘤組織HIF-1α免疫組織化學(xué)染色圖(×100) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為HIF-1α陽性細(xì)胞，造模第14天(A)陽性細(xì)胞較第21天(B)及28天(C)減少，第28天(C)陽性細(xì)胞較第21天減少

以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒狀物判定為HIF-1α染色陽性。低倍鏡(×100)下觀察切片，隨機選擇5個HIF-1α陽性細(xì)胞密集區(qū)，高倍鏡(×200)下對密集區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞(排除非特異性染色細(xì)胞)。根據(jù)視野內(nèi)HIF-1α陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比及陽性細(xì)胞染色程度對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分：無HIF-1α陽性細(xì)胞為0分，HIF-1α陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比<10%為1分、10%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分；細(xì)胞質(zhì)無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以2項評分的乘積作為HIF-1α評分結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較各時間點間IVIM-DWI參數(shù)及HIF-1α評分的差異，2時間點間比較采用SNK-q檢驗。以Pearson相關(guān)分析觀察各時間點IVIM-DWI參數(shù)與HIF-1α評分的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

常規(guī)MRI：造模第14天腫瘤組織呈T1WI低信號、T2WI稍高信號；造模第21天腫瘤組織較造模第14天稍增大，呈T1WI低信號、T2WI稍高信號；造模第28天腫瘤內(nèi)見壞死區(qū)，壞死區(qū)呈T1WI低信號、T2WI高信號。HE染色：造模第14天腫瘤細(xì)胞分布密集；第21、28天見部分腫瘤細(xì)胞壞死，壞死區(qū)細(xì)胞數(shù)減少、細(xì)胞核裂解，且第28天壞死區(qū)面積較第21天增大。

2.1 各時間點IVIM-DWI參數(shù)及HIF-1α評分比較 造模第14、21及28天，IVIM-DWI各參數(shù)及HIF-1α評分比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。與造模第14天比較，造模第21天ADC、D、f及HIF-1α評分均升高，D*降低；造模第28天ADC值、D及HIF-1α評分均升高，f降低；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與造模第21天比較，造模第28天D*升高、f及HIF-1α評分均降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 IVIM-DWI參數(shù)與HIF-1α評分的相關(guān)性 造模第14天IVIM-DWI各參數(shù)與HIF-1α評分均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)；造模第21天D、D*、f與HIF-1α評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.73、-0.58、-0.67，P均<0.05)；造模第28天D、f與HIF-1α評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.60、-0.65，P均<0.05)；造模第21及28天HIF-1α評分與ADC均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。

3 討論

膠質(zhì)瘤通過刺激新生血管生成以保證氧氣及其他營養(yǎng)成分的供應(yīng)，但新生血管內(nèi)皮細(xì)胞功能不全，當(dāng)腫瘤細(xì)胞氧消耗大于氧供應(yīng)，且營養(yǎng)成分如糖類等供給不能滿足細(xì)胞增殖所需時，造成腫瘤微環(huán)境乏氧，腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)乏氧區(qū)；乏氧嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)胞壞死、細(xì)胞核裂解，并逐漸發(fā)展為壞死區(qū)[7-8]。膠質(zhì)瘤組織出現(xiàn)乏氧壞死區(qū)是導(dǎo)致其耐藥、預(yù)后不良的原因之一。目前臨床主要通過檢測氧分壓評估膠質(zhì)瘤微環(huán)境的乏氧狀態(tài)及程度，但該檢查有創(chuàng)，患者接受度低；PET等影像學(xué)方法亦可用于評估膠質(zhì)瘤微環(huán)境的乏氧狀態(tài)及程度，但具有輻射。

IVIM-DWI以多b值獲取系列DWI圖像，根據(jù)雙指數(shù)模型擬合，獲得組織擴散系數(shù)和微毛細(xì)血管灌注信息[9]。低b值掃描獲得的DWI反映組織內(nèi)血流灌注及水分子擴散，且以對前者的反映為著；高b值掃描圖像僅反映組織水分子擴散；故采用多b值掃描的IVIM-DWI可將腫瘤組織血流灌注和水分子擴散分開，且無創(chuàng)、無需使用對比劑[10]。有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，IVIM-DWI可用于指導(dǎo)膠質(zhì)瘤術(shù)前病理分期、鑒別高級別膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤等。本研究擬采用IVIM-DWI評估SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型腫瘤微環(huán)境乏氧狀態(tài)。

既往研究[13]報道，氧敏感轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α可感知腫瘤細(xì)胞氧及葡萄糖缺乏，表現(xiàn)為HIF-1α在腫瘤組織鄰近壞死區(qū)周圍的乏氧區(qū)高表達(dá)。本研究免疫組織化學(xué)化染色結(jié)果顯示，造模第14、21及28天HIF-1α評分比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，且造模第21及28天HIF-1α評分均高于第14天，提示隨著膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)乏氧；但造模第28天HIF-1α評分較第21天降低，可能原因為造模第21、28天腫瘤內(nèi)出現(xiàn)壞死區(qū)，且第28天壞死區(qū)面積大于第21天，使乏氧區(qū)相對減小，HIF-1α表達(dá)降低。

IVIM-DWI結(jié)果顯示，造模第14、21及28天IVIM-DWI各參數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，且造模第21天D、D*、f與HIF-1α評分均呈負(fù)相關(guān)，造模第28天D、f與HIF-1α評分均呈負(fù)相關(guān)，提示IVIM-DWI可能反映腫瘤微環(huán)境的乏氧狀態(tài)。造模第28天ADC、D與第21天比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，可能原因為選取ROI時人為避開壞死區(qū)，使2個時間點ROI內(nèi)腫瘤細(xì)胞密度相似，水分子擴散受限程度亦相似；造模第14天與第28天D*比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是造模第28天時腫瘤內(nèi)乏氧區(qū)發(fā)展為壞死區(qū)，腫瘤組織內(nèi)血流發(fā)生變化，導(dǎo)致檢測到的D*可能存在誤差。造模第21、28天時HIF-1α評分與D均呈負(fù)相關(guān)，可能原因為這2個時間點腫瘤乏氧區(qū)HIF-1α表達(dá)水平較高，且乏氧區(qū)腫瘤細(xì)胞數(shù)量多、排列密集，導(dǎo)致水分子擴散受限。造模第21、28天HIF-1α評分與f呈負(fù)相關(guān)，f與血流量及血容量有關(guān)，反映腫瘤組織的灌注情況，造模第21、28天腫瘤細(xì)胞增殖快，能量及營養(yǎng)缺乏，HIF-1α表達(dá)增加，但壞死區(qū)的出現(xiàn)使血液灌注相對下降，故HIF-1α評分與f呈負(fù)相關(guān)。造模第21天HIF-1α評分與D*呈負(fù)相關(guān)，而造模第28天二者無明顯相關(guān)性，可能原因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血流量相較于其他系統(tǒng)少，且D*易受腫瘤內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性及乏氧區(qū)血供等因素干擾，影響D*準(zhǔn)確性[14]。造模第14天時IVIM各參數(shù)與HIF-1α評分均無明顯相關(guān)性，原因可能為造模第14天腫瘤體積較小，血液及糖類等營養(yǎng)供給尚可，尚未形成明顯乏氧及壞死區(qū)。造模第14、21及28天時HIF-1α評分與ADC均無明顯相關(guān)性，可能原因為膠質(zhì)瘤細(xì)胞異型性和水分子擴散運動的復(fù)雜性，使ADC不能準(zhǔn)確反映腫瘤細(xì)胞密度等特征。

綜上所述，IVIM-DWI能夠用于評價SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型腫瘤微環(huán)境乏氧狀態(tài)。但隨著乏氧程度增加，壞死區(qū)逐漸增大，導(dǎo)致腫瘤組織血流發(fā)生變化、腫瘤細(xì)胞侵襲性增加等，影響IVIM-DWI參數(shù)的準(zhǔn)確性；此外，本研究樣本量相對較少，且選取ROI時人為避開壞死區(qū)，動物模型受飼養(yǎng)環(huán)境等影響，HIF-1α免疫組織化學(xué)結(jié)果受染色環(huán)境、大鼠灌注效果等影響；故本研究尚需進(jìn)一步完善。