遲鵬 彭建 谷付星

摘要：在對微納材料光學特性表征中，需要獲得分辨率更高的波長和強度的熒光圖像。普通的顯微鏡無法滿足測試的要求，因此將普通的成像顯微鏡、光譜儀以及納米移動臺組成激光掃描顯微鏡成像系統(tǒng)，并利用LabVIE開發(fā)了一套完整的集二維掃描采集與信號圖像處理一體的系統(tǒng)上位機軟件。掃描采集過程使用了低通濾波等數(shù)字信號處理方法消除光譜儀信號噪聲的影響。利用本系統(tǒng)測量硒化鎘納米帶、單層二硫化鉬得到了熒光強度圖像以及熒光峰值波長圖像，能分辨出最小波長為0.03nm的熒光。將采集長度與實際長度進行比較并分析熒光強度差異，取得了較好的效果。

關鍵詞：激光掃描成像;LabVIEW;光譜儀去噪;熒光峰值波長圖像;熒光強度圖像

中圖分類號：0433.1;0435.1 文獻標志碼：A

引言

激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scan-ning microscope，CLSM）是20世紀80年代中期發(fā)展起來并得到廣泛應用的新技術。CLSM用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，其優(yōu)良的性能在半導體、材料科學、生物醫(yī)學等領域具有廣泛的應用。

激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)采用精密的針孔濾波技術，使其不僅能夠保持高清晰度和層析成像能力，同時能對不同熒光成分選擇成像，確定熒光成分的含量。在光譜成像共聚焦顯微鏡中，有多種分光方案，張運海等利用棱鏡分光移動狹縫的方法，得到了5～300mm波長分辨率的熒光圖像。李葉等利用不同的帶通濾波片得到不同波段的熒光。目前市面上的激光共聚焦掃描顯微鏡采集系統(tǒng)部分采用可調諧帶通濾波片和光電探測器連用，其最高分辨率為10mm左右。對于觀察半導體微納材料的自吸收，例如單層二硫化鉬、硒化鎘納米帶、納米線等其熒光峰值波長改變量不足1 nm，因此具有測量高精度波長分辨率的熒光顯微鏡是必要的。

1系統(tǒng)構成

測量熒光光譜系統(tǒng)采用的是普通光學顯微鏡改裝的激光掃描成像顯微鏡，如圖1所示，主要包括激光光源、光學顯微鏡、納米移動臺、二向色鏡、聚焦鏡以及光譜儀組成。激光器選用的是波長為532nm的激光器，激光器發(fā)出的激光光斑直徑為1mm，所以要先對激光進行縮束，利用兩個不同焦距的凸透鏡搭成的望遠鏡光路將光斑縮小為100um。激光通過二向色鏡反射進入100倍的聚焦物鏡中進一步將光斑縮小，縮小的光斑照射在樣品上使樣品激發(fā)熒光，并通過物鏡進行熒光收集，所得的光經過聚焦鏡聚焦后將熒光通入光譜儀進行采集。納米移動臺對樣品區(qū)域進行移動掃描，納米移動臺的行程為4 mm，位移精度10nm，能夠達到實驗所需精度。

2程序設計

2.1軟件設計

圖2為熒光圖像系統(tǒng)的結構功能圖，其主要包括系統(tǒng)配置和數(shù)據(jù)采集兩個方面。系統(tǒng)配置是將實驗儀器的通訊以及參數(shù)進行設置，數(shù)據(jù)采集是利用本套系統(tǒng)能夠得到的所有數(shù)據(jù)信息。圖3是采集程序的程序面板和流程圖。進入程序后，首先進行系統(tǒng)配置，需要將激光器、光譜儀、納米移動臺的設備串口編號選擇輸入程序，并對儀器進行初始化。初始化完成后，選擇本次采集所得文件的存儲目錄，設置光譜儀的積分時間、濾波參數(shù)、納米移動臺的起始位置和終止位置以及采集步長，確定采集分辨率。系統(tǒng)設置完成后，點擊確定進入數(shù)據(jù)采集，在數(shù)據(jù)采集界面中實時顯示納米移動臺在每一次移動時獲得的光譜，將光譜的熒光峰值強度以及波長挑選出來，繪制在強度三維圖和波長三維圖中。界面中有一個采集時間顯示模塊，可以觀察本次采集已經經過的時間以及距離完成所需的剩余時間，方便操作者得到采集數(shù)據(jù)。

2.2光譜儀信號處理

光譜儀的原理是使用光柵分光后將光打入線陣CCD中，將光信號轉化為電信號。使用的過程中會有熱噪聲，測試背景產生的其他光噪聲以及數(shù)據(jù)采集卡的模擬干擾信號，所以要對光譜儀采集的信號進行處理以提取想要獲得的信號。針對三種噪聲，本文采用均值濾波、低通濾波以及背景扣除法來處理采集到的信號。

均值濾波是信號處理的常用方法，它有著計算速度快和容易實現(xiàn)等優(yōu)點，其原理是對光譜儀多次采集的波長強度信號加權平均，得到的平均值作為光譜儀采集的強度值。

低通濾波采用的是FIR（finite impulse response）濾波器濾波，它可以在保證任意幅頻特性的同時具有嚴格的線性相頻特性，同時保證其單位抽樣響應是有限長的，其原理是信號通過一個FIR濾波器與其系數(shù)進行卷積（即乘累加）的過程。在本實驗中主要使用其低通功能，將光譜儀采集的高頻信號進行濾除。

光譜儀在無光條件下會產生暗電流，在開啟后遮擋住進光口，對其信號進行收集，并和后來采集到所需要的信號值進行相減以扣除暗電流噪聲。

在對光譜儀信號采集的過程中，使用上述三種濾波方法依次對光譜儀采集的初始信號進行濾波。將經過三種濾波后的圖像進行對比如圖4所示，其中圖（a）為未經濾波光譜儀的信號圖譜，圖（b）為濾波后光譜儀信號圖譜，可以看到，在濾波前光譜儀的信號平均強度在1150左右，噪聲幅值有200，信號幾乎無法觀察。經過濾波后，無信號的波長強度值在0附近，噪聲幅值僅有20，能明顯觀察到560～740nm波段的信號。

3圖像分析比較

將光譜儀測得的強度信息和波長信息進行提取，以納米移動臺的橫縱坐標為XY軸，強度和波長信息作為z軸即可得到熒光強度圖像和熒光峰值波長圖像。圖5（a）（d）（g）分別是單層二硫化鉬、硒化鎘納米帶和硒化鎘納米線在照明光下的顯微鏡圖，圖5（b）（e）（h）是利用熒光成像系統(tǒng)采集對應熒光強度圖以及（c）（f）（i）是采集對應熒光峰值波長圖。每種樣品采集的圖像在照明光下的實際長度和使用搭建的系統(tǒng)的邊長對比如表1所示。

表1中實際長度是在照明光條件下利用CCD相機進行測量所得的長度值，步進長度為納米移動臺每次采集所前進的步長，像素數(shù)為采集圖像轉為bmp格式圖片后測量邊長所得的像素點個數(shù)，步進長度與像素數(shù)的乘積即為掃描系統(tǒng)所采集的長度。從表中可以看出，利用熒光成像系統(tǒng)采集的長度與實際長度的誤差值在1um以內。

觀察圖4的熒光強度圖像（b）（e）（h），發(fā)現(xiàn)在硒化鎘納米帶兩端強度最高，其最高強度值為588，而在納米帶的中間部分強度值明顯低于兩端僅有220左右，硒化鎘納米線也有相同的現(xiàn)象，即在兩端的強度明顯高于中間，而對于微納材料單層二硫化鉬的強度其邊緣處的強度與中間的強度相差不大。上述現(xiàn)象說明硒化鎘納米材料中存在一種導波模式，當激光照射激發(fā)其本征熒光時，熒光一部分向外部發(fā)射，另一部分在樣品端部表面進行多次全反射，在納米線的兩端進行積累，形成類似于FP腔的循環(huán)增益結構，最終熒光從兩端射出。當激光激發(fā)位置在兩端時，采集到的熒光包括外部發(fā)射的熒光以及在納米材料表面?zhèn)鬏數(shù)墓獠?，強度明顯高于中間位置。而在單層二硫化鉬中，由于材料厚度太?。?.8nm），在微納材料表面?zhèn)鬏數(shù)墓鉄o法通過端面反射返回原來位置，不能形成類似于FP腔的增益結構，表面的光波從微納材料的任意邊界射出，邊界處的熒光強度略微高于中間。

觀察圖5的熒光峰值波長圖像（c）（f）（i），發(fā)現(xiàn)硒化鎘納米帶和納米線兩端的最強波長與中間的最強波長不同，其兩端波長相對中間發(fā)生了紅移，相比于中間移動了3nm左右。單層二硫化鉬則沒有發(fā)生紅移，其中部與邊緣僅僅只是強度差異。這是因為在硒化鎘納米線中由于熒光在兩端的強度大，導致硒化鎘的自吸收效應使發(fā)射波長發(fā)生紅移。

將圖5采集微納材料的熒光峰值強度圖與熒光峰值波長圖作為對比，發(fā)現(xiàn)熒光峰值波長圖所測量的大小明顯大于熒光峰值強度圖。因此將采集硒化鎘納米帶的波長三維圖以及強度三維圖的橫截面與利用原子力顯微鏡（AFM）所測量的納米帶寬度的截面信息進行作圖，結果如圖6所示。圖b（a）為硒化鎘納米帶的波長截面圖，圖6（b）為硒化鎘納米帶的強度截面圖像，圖6（c）為硒化鎘納米帶的寬度截面圖。我們可以觀察到采集的兩張三維圖的長度均比實際長度長，利用AFM測量納米帶的寬度為1 682um，強度截面所得到的寬度為2.4岬，波長截面圖的長度與實際長度相差最大為4.2 um。因為在進行高分辨率采集時，由于激光光斑的大小限制，微納材料邊緣的熒光會從小到大逐漸增強直至光斑完全照射在微納材料上，而熒光峰值波長只需要產生熒光就可以采集到相近的波長，最終在顯示時由于熒光強度在比較低時顯示程度較弱，熒光峰值波長圖所測量的大小明顯大于實際長度，導致在測量納米級別的長度時導致圖像不準確。

4結論

本實驗采用的是利用光譜儀和顯微鏡系統(tǒng)搭建的實驗裝置，光譜儀可以采集出目標點350～900nm的可見光全光譜，并可以將所有掃描點的光譜圖保存起來便于分析。利用光譜儀直接讀取樣品激發(fā)的熒光信號，設置采集的積分時間，觀察較弱的熒光信號可以進行長時間的積分曝光來提高信噪比可以得到熒光的波長信息和強度信息。同時由于光譜儀依靠光柵分光，可以得到高精度的熒光信號。依靠本實驗制作的熒光掃描顯微鏡可以分辨出最小0.03nm的波長差異，相比于普通的共聚焦顯微鏡在波長分辨方面有著較大的提高。

同時利用LabVIEW軟件的讀取功能，在完成該點掃描后立即得到所需要的數(shù)據(jù)并在全部掃描后，得到所需的強度圖像和熒光圖像，并分析得到的圖像產生的誤差的原因。根據(jù)這些圖像信息經過處理可以精確的顯示微納材料不同位置的發(fā)光強度差異以及發(fā)光波長差異，能夠更好地研究微納材料的結構信息以及生長缺陷。