陳苗苗 董金杰 杜 平 王超英 （中農(nóng)威特生物科技股份有限公司 甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫(Foot-and-mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus， FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和快速遠距離傳播的疫病，目前對患病牲畜尚無有效的治療方法，只有使用口蹄疫疫苗接種動物進行積極預防[1]。常規(guī)滅活疫苗仍然是當前FMD免疫控制采用的主要疫苗，又以法國SEPPIC公司的ISA206雙相油佐劑疫苗為市場主導疫苗，隨著疫苗技術的發(fā)展，新型佐劑成為現(xiàn)在研究的熱點，尤其以納米佐劑和凝膠佐劑為主，該新型載體穩(wěn)定、安全、靶向、緩釋等優(yōu)點克服了普通疫苗的缺點[2，3]，本研究通過三組新型疫苗載體配制的疫苗，以常規(guī)206佐劑乳化配制的疫苗作對照，較全面比較評價四組佐劑配制的疫苗物理性狀和小鼠體液免疫應答水平，為以后的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原與佐劑 （1）抗原：口蹄疫O型滅活抗原(本公司生產(chǎn)部提供)。（2）佐劑：IMS1313納米佐劑(SIPPIC公司提供)、M12納米乳佐劑(本部門研制)、HA凝膠佐劑(佳木斯大學材料學院提供)、ISA206油佐劑(SEPPIC公司提供)。

1.1.2 儀器與試劑 磁力攪拌器(德國IKA)、激光粒度分析儀(美國貝克曼)、臺式高速微量離心機(賽默飛世爾)、酶標儀(購自博樂公司)、口蹄疫血清抗體檢測ELISA試劑盒(購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所)。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳化 IMS1313納米佐劑、M12納米乳佐劑、HA凝膠佐劑、ISA206油佐劑分別121℃高壓滅菌30min，同一批次口蹄疫O型抗原無菌分裝四份，146s為10ug/ml。IMS1313納米佐劑、M12納米佐劑分別在室溫下與該抗原按質(zhì)量比1：1預混合，磁力攪拌器1000r/min乳化5min，分裝10ml鏈瓶中。ISA206佐劑與該抗原(30±2)℃水浴30min，按質(zhì)量比1：1預混合，磁力攪拌器1000r/min乳化5min，分裝10ml鏈瓶中。該抗原做2倍稀釋后與HA凝膠佐劑按質(zhì)量比6：1預混合，磁力攪拌器1000r/min乳化5min，分裝10ml鏈瓶中。

1.2.2 性狀檢測 按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行性狀檢驗。粘度檢測：用1ml吸管(出口內(nèi)經(jīng)1.2mm)分別吸取25℃疫苗，垂直自然流出，計算0.4ml流出所需要的時間。離心檢測：用10ml離心管加入10ml疫苗，以3000r/min離心30min。劑型檢測：取一潔凈吸管，分別吸取四組疫苗。滴于25℃無離子水表面，第一滴下部呈拖尾狀或部分分散為水包油包水，若疫苗在水中迅速擴散溶于水中即為水劑。粒度檢測：用1ml吸管吸取疫苗滴于粒度儀樣品池中3滴，按預先設置好的參數(shù)，讀取粒度值。穩(wěn)定性放置試驗：疫苗分別存放在4、25、37℃，放置3、7、30、90、180、365d。觀察穩(wěn)定性情況。

1.2.3 小鼠免疫試驗 （1）血清特異性IgG檢測：將滅活抗原分別與ISA206佐劑、IMS1313佐劑、HA凝膠佐劑以及M12納米佐劑乳化的疫苗，分別免疫20g雌性BALB/C小鼠10只，免疫劑量為0.5ml[4]，分別在免疫后每隔7天斷尾靜脈采血，共計90d，用口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒檢測血清抗體，初步測定四組佐劑乳化的疫苗對小鼠的免疫抗體水平以及消長情況。（2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計：試驗結(jié)果表示為平均值±標準差，數(shù)據(jù)釆用SPSS(11.5)軟件進行One-way ANOVA中的LSD分析方法進行組間多重比較，以P＜0.05為差異顯著，采用Microsoft Office Excel 2003軟件進行繪圖。

2 結(jié)果

試驗結(jié)果見表1。

表1 4組佐劑配制疫苗的物理性狀檢測結(jié)果比較

2.1 物理性狀檢測

4種佐劑分別與口蹄疫O型滅活抗原乳化配制疫苗，物理性狀檢測結(jié)果均達到質(zhì)量標準，納米乳M12佐劑乳化的疫苗與206佐劑乳化的疫苗都是雙相W/O/W疫苗，M12佐劑乳化的疫苗粒徑為納米級小于100nm，206佐劑乳化的疫苗粒徑為微米級，2.13um，離心檢測均未出現(xiàn)明顯分層，粘度檢測均在2～8s的容許范圍，商用納米佐劑IMS1313、羥基磷灰石HA凝膠佐劑配制的疫苗為水溶液，離心檢測溶液澄清均一。

2.2 放置試驗

4種佐劑乳化的疫苗放置在25℃、4～8℃以及37℃，觀察疫苗分層情況，在4℃以及25℃，四組疫苗均未出現(xiàn)明顯分層，37℃自制的M12佐劑配制的疫苗和商用IMS1313佐劑、HA凝膠佐劑配制的疫苗均未出現(xiàn)明顯分層，ISA206佐劑乳化的疫苗出現(xiàn)明顯分層。

2.3 對小鼠的免疫試驗

4種佐劑與同批O型口蹄疫滅活抗原配制的疫苗分別免疫10只BALB/C小鼠，用液相阻斷ELISA方法測定O型抗體效價，并計算Log10(效價)對照值求平均數(shù)及標準差，抗體結(jié)果如下表：

表2 4組佐劑配制的疫苗免疫90d的抗體結(jié)果

表2結(jié)果顯示，4組疫苗在免疫后28d抗體水平均達到最高值，自制M12納米佐劑疫苗組均值為2.75，IMS1313納米佐劑疫苗組為2.56，HA凝膠疫苗組為1.51，ISA206佐劑疫苗組為2.72，90d后，M12納米佐劑疫苗組降到2.31，IMS1313納米佐劑疫苗組降到0.64，HA凝膠疫苗組降到0.49，ISA206佐劑疫苗組降到1.58.結(jié)果見附圖。

附圖 4種佐劑配制的疫苗90d內(nèi)血清平均抗體效價消長情況

從附圖中可以看出，自制M12佐劑配制的疫苗平均抗體均高于其他3組，能顯著提高小鼠血清中FMDV特異性IgG水平(P＜0.05)。

3 討論

（1）本試驗對適用于口蹄疫生產(chǎn)的疫苗佐劑包括自制納米乳佐劑M12、法國賽彼克公司的納米佐劑IMS 1313、ISA206以及HA凝膠佐劑的乳化效果進行了評價。自制納米乳佐劑M12為納米級水包油包水佐劑，IMA1313為復合水溶性納米佐劑，ISA206佐劑為常規(guī)水包油包水佐劑，HA凝膠佐劑為吸附性顆粒物佐劑，選擇這四種不同類型的佐劑考察它們的乳化效果。水包油包水乳劑粘度低，并且能提高短期和長期的免疫反應。水包油包水乳劑通常誘導體液免疫反應[5]。外部水相中的抗原可立即作用于免疫系統(tǒng)，而內(nèi)部水相的抗原就像在油包水乳劑中一樣緩慢釋放。而納米佐劑疫苗粒徑小、分散性好、比表面積大，易于體內(nèi)吸收，能提高藥物生物利用度，能顯著提高細胞免疫應答[6，7]，本實驗室研制的納米乳佐劑M12具備了水包油包水佐劑和納米佐劑的優(yōu)點，能更好的適用于口蹄疫疫苗中。本試驗通過劑型、粘度、離心、粒徑檢測以及放置試驗，較全面了解了這四種不同類型的口蹄疫疫苗佐劑的物理性狀及穩(wěn)定性，為以后應用于口蹄疫生產(chǎn)提供理論依據(jù)，試驗結(jié)果顯示，這四種佐劑疫苗均達到質(zhì)量標準。（2）四種佐劑分別與同批次O型滅活抗原乳化配制疫苗免疫BALB/C小鼠，分別在免疫后90d內(nèi)每隔7d進行斷尾靜脈采血，其血清用液相阻斷ELISA方法檢測，比較IgG抗體水平差異以及消長情況。自制納米乳佐劑M12乳化的疫苗平均抗體水平最高，且在90d內(nèi)維持在2.1的較高水平，賽比克公司的IMS1313納米佐劑以及ISA206雙相油佐劑乳化的疫苗平均抗體水平次之，且在28d達到較高水平值2.7(1：512)，28d以后下降明顯，IMS1313降幅比ISA206佐劑疫苗大，這與該佐劑的劑型有關[8]，由于納米顆粒佐劑疫苗為水溶性物質(zhì)，雖然能較快的產(chǎn)生抗體，但緩釋和控釋的作用較弱[9]，HA凝膠佐劑疫苗90d內(nèi)無明顯變化，IgG抗體水平均最低，不能很好的達到免疫效果。比較四種佐劑，自制納米乳佐劑M12乳化的疫苗平均抗體效價最高且長效[10，11]。