劉建新，歐曉彬，王金成

(甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室/隴東學院生命科學與技術學院，甘肅 慶陽 745000)

隨著工業(yè)發(fā)展和農業(yè)中化肥、農藥大量使用，土壤重金屬污染日益嚴重。鎘(cadmium, Cd)是最具植物毒性的重金屬元素之一，主要以離子型化合物形態(tài)存在，容易被植物根系吸收并轉移到籽粒中積累，進而通過食物鏈危及人類健康[1]。植物遭受Cd脅迫時會誘導細胞代謝酶活性下降[2]、根系營養(yǎng)元素吸收轉運受阻[3]、葉片光系統(tǒng)電子傳遞活性[4]和光合速率[5]降低、地上部Cd吸收積累增加、葉綠素含量和植物生長量降低[6]。因此，探索提高植物Cd脅迫耐性的措施或技術途徑，是緩解植物Cd脅迫傷害亟需解決的問題。

過氧化氫(Hydrogen peroxide, H2O2)是參與植物生長發(fā)育和脅迫應答調節(jié)的一種重要信號分子。研究證明，內源性H2O2代謝的調控有助于轉基因水稻光合能力的提高[7]和誘導大豆根尖及邊緣細胞的耐鋁反應[8]。外源H2O2能夠增強葡萄對低溫[9]和玉米對鹽脅迫[10]的耐性，緩解干旱對黃瓜葉綠體膜的傷害[11]，增強受旱歐薄荷的光合性能[12]。關于H2O2增強植物對金屬脅迫耐性方面的研究表明：外源H2O2能夠提高黑豆對鋁脅迫的耐性[13]，抑制水稻根系Cd向地上部的轉移[14]，提高Cd脅迫蠶豆的抗氧化能力[15]，通過調節(jié)光系統(tǒng)Ⅱ活性和氣孔運動，維持鎳脅迫下芥菜較高的光合潛力[16]。

裸燕麥(AvenanudaL.) 是我國西北、西南和華北等地廣泛種植的禾本科燕麥屬雜糧作物，其籽粒的蛋白質和脂肪含量遠高于小麥、水稻等主要糧食作物，尤其是其富含的β-葡聚糖和燕麥黃酮對控制血脂、血壓和血糖升高及改善胃腸功能具有保健功效[17]。裸燕麥具有較強的耐鹽抗旱和耐貧瘠特性，常種植在鹽堿地或受重金屬污染等質地較差的土壤上，土壤重金屬成為制約其生長發(fā)育的重要因素。有研究表明，根施H2O2可緩解Cd脅迫對裸燕麥生長的抑制[18]。然而，外源H2O2減輕Cd脅迫傷害的生理機制仍尚不清楚。為此，本研究以西北地區(qū)廣泛種植的高產(chǎn)抗旱抗病裸燕麥品種‘定莜6號’為材料，通過砂培試驗，研究噴施H2O2對Cd脅迫下植株生長及葉綠素熒光參數(shù)、光系統(tǒng)吸收光能分配和Cd積累的影響，探討H2O2對Cd脅迫下裸燕麥生理響應的調控機制，以期為應用H2O2增強作物耐鎘性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試裸燕麥品種‘定莜6號’種子購自甘肅省定西市農業(yè)科學研究院。30% H2O2為Sigma公司產(chǎn)品，分析純氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)作為Cd供體。

挑選均勻、飽滿的裸燕麥種子用5%次氯酸鈉將其表面消毒、洗凈后晾干，播種在口徑20 cm、高14 cm的塑料盆中，以清水充分洗凈的膨脹珍珠巖(未檢出Cd)作基質，每盆播種量約80粒，澆500 mL水后置日光溫室中培養(yǎng)，常規(guī)管理。溫室內晝/夜溫度為(24～37)℃/(16～22)℃，光照強度為400～560 μmol·m-2·s-1，濕度70%±10%。當幼苗長至2片葉子時進行間苗，每盆保留一致壯苗約50株，并澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液250 mL補充養(yǎng)分，當幼苗第3片葉完全展開時進行試驗處理。

1.2 試驗設計

前期預實驗發(fā)現(xiàn)50 mg·L-1Cd2+溶液澆灌3葉期裸燕麥幼苗14 d后光合速率和植株干重顯著低于澆灌蒸餾水的對照。因此，Cd脅迫濃度設定為50 mg·L-1Cd2+。H2O2噴施的有效生理濃度為1.5～10 mmol·L-1 [11，19-20]。據(jù)此，Cd脅迫和H2O2噴施交叉試驗設置如下4個處理：(1) CK，用蒸餾水噴施幼苗葉面，用Hoagland營養(yǎng)液根部澆灌幼苗；(2)H2O2處理，用5 mmol·L-1H2O2噴施幼苗葉面，用Hoagland溶液根部澆灌幼苗；(3) Cd處理，用蒸餾水噴施幼苗葉面，用含50 mg·L-1Cd2+的Hoagland溶液根部澆灌幼苗；(4) H2O2+ Cd處理，用5 mmol·L-1H2O2噴施幼苗葉面，用含50 mg·L-1Cd2+的Hoagland溶液根部澆灌幼苗。葉面噴施與根部澆灌于2017年5月14日20∶00時同時進行，噴施液中加0.5% Tween-20以增加與葉面的粘附程度，噴施量每盆15 mL左右，澆灌量每盆約300 mL。葉面噴施和根部澆灌每隔2 d進行1次，處理14 d后進行各項指標測定。試驗重復3次。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 植株生長量 取30株幼苗，洗凈后從根結處分成根系和地上部，置烘箱105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，稱干重，重復3次。

1.3.2 葉黃素循環(huán)色素物質 取0.50 g幼苗第2～3片葉凍樣于預冷研缽中，加入85%丙酮5 mL研磨勻漿后轉移至離心管以4 000 r·min-1離心5 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，按Cheng[21]的方法用LC-3000型高效液相色譜儀測定葉黃素循環(huán)色素紫黃質(V)、環(huán)氧玉米黃質(A)和玉米黃質(Z)的含量，以(A+Z)/(V+A+Z)表示脫環(huán)氧化狀態(tài)。

1.3.4 Cd含量 將植株從盆中取出后充分洗凈，根部浸入0.2 mol·L-1EDTA-Na2溶液30 min以除去表面吸附的Cd，再用蒸餾水沖凈后吸干表面水分，將根系和地上部分開，置烘箱105℃殺青0.5 h，70℃烘干至恒重，分別稱干重。然后粉碎、磨細、過1 mm尼龍篩，參照Zhang等[26]的方法分別稱取0.500 g根系和地上部樣品，用20 mL混合酸(HNO3∶HClO4=4∶1，V/V)消煮后定容至50 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾后用日立ZA3000原子吸收分光光度計測定Cd含量，并計算Cd積累量=植株根系或地上部Cd含量×根系或地上部生物量，轉運率(%)=植株地上部Cd含量/根系Cd含量×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0方差分析和Duncan法多重比較(P<0.05)，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗生長量的影響

從圖1可見，與CK相比，單施H2O2處理對裸燕麥幼苗根系干重無顯著影響，但顯著提高了裸燕麥幼苗地上部干重。Cd處理顯著降低了裸燕麥幼苗根系和地上部干重，分別比CK下降了33.2%和32.0%。H2O2+Cd處理的幼苗根系和地上部干重分別比Cd處理提高了18.5%和26.9%，差異顯著。

注：圖中不同字母表明同一組織不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters indicate the significant differences among treatments at 0.05 levels for the same tissue.圖1 外源H2O2對Cd脅迫裸燕麥幼苗干重的影響Fig.1 Effect of exougeous H2O2 on dry weight of naked oat seedlings under Cd stress

2．2 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片葉黃素循環(huán)組分和脫環(huán)氧化狀態(tài)的影響

從表1可知，與CK相比，單獨H2O2處理顯著降低了裸燕麥幼苗葉片中紫黃質(V)的含量，而環(huán)氧玉米黃質(A)和總葉黃素(V+A+Z)含量差異不顯著，玉米黃質(Z)含量和脫環(huán)氧化狀態(tài)(A+Z)/(V+A+Z)顯著提高。Cd脅迫下的V和(V+A+Z)含量顯著低于CK，分別降低了49.4%和9.9%，而A、Z含量和(A+Z)/(V+A+Z)顯著高于CK，分別提高24.3%、21.6%和35.8%。與Cd脅迫處理相比，外源H2O2+Cd處理顯著提高了V含量，增幅為23.8%，卻顯著降低了A、Z、(V+A+Z)含量和(A+Z)/(V+A+Z)，降幅分別為37.8%、7.5%、5.1%和11.2%。

2．3 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

從表2可見，單獨H2O2處理的裸燕麥幼苗葉片PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學效率(ΦPSⅡ)、光化學猝滅系數(shù)(qP)、非光化學猝滅系數(shù)(NPQ)、調節(jié)性能量耗散Y(NPQ)和非調節(jié)性能量耗散Y(NO)均與CK無顯著差異。與CK相比，Cd脅迫顯著降低了Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP，降幅分別為21.1%、70.8%和54.7%，NPQ、Y(NPQ)和Y(NO)分別顯著提高了72.3%、70.6%和24.7%。與Cd處理相比，H2O2+Cd處理顯著提高了Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP，增幅分別為15.7%、98.6%和61.6%，而NPQ、Y(NPQ)、Y(NO)明顯降低，降幅分別為7.9%、13.9%和12.2%。

2．4 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片兩光系統(tǒng)間激發(fā)能分配的影響

如表3所示，單獨H2O2處理的裸燕麥幼苗葉片PSⅠ激發(fā)能分配系數(shù)(α)、PSⅡ激發(fā)能分配系數(shù)(β)和兩光系統(tǒng)間激發(fā)能分配的不平衡系數(shù)(β/α-1) 均與CK無顯著差異。與CK相比，Cd脅迫顯著降低了α，提高了β和β/α-1。H2O2+Cd處理的α比單獨Cd處理提高了40.9%，而β和(β/α-1)分別下降了12.7%和55.2%。

2．5 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片PSⅡ吸收光能分配的影響

從表4可見，單獨H2O2處理的裸燕麥幼苗葉片光化學反應份額(P)、天線熱耗散份額(D)和非光化學反應耗散的份額(Ex)與CK無顯著差異。Cd脅迫下P較CK顯著降低了70.8%，D和Ex分別顯著升高了83.0%和40.7%。與Cd處理相比，H2O2+Cd處理的P顯著提高了98.6%，而D和Ex分別顯著降低了19.1%和10.6%。

2．6 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗Cd吸收積累和轉運率的影響

由表5可知，與CK相比，單獨H2O2處理對裸燕麥幼苗根系和地上部Cd含量、Cd積累量和Cd轉運率均沒有顯著影響。Cd脅迫顯著提高了根系和地上部Cd含量、Cd積累量及轉運率，其中根系Cd含量和Cd積累量均大于地上部。與Cd處理比較，H2O2+Cd處理顯著提高了根系Cd含量，而對地上部Cd含量無顯著影響；根系和地上部Cd積累量顯著提高，而Cd轉運率則顯著下降。

表1 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片葉黃素循環(huán)組分和脫環(huán)氧化狀態(tài)的影響

表2 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

表3 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片兩光系統(tǒng)間激發(fā)能分配的影響

表4 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗葉片PSⅡ吸收光能分配的影響

表5 外源H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗Cd吸收積累和轉運率的影響

3 討 論

生長量是植物對Cd脅迫耐性的直接反映[3]。本試驗表明，用5 mmol·L-1H2O2噴施可緩解50 mg·L-1Cd2+脅迫對裸燕麥幼苗生長的抑制(圖1)。這與Hu等[14]以水稻為材料的研究結果一致。說明外源H2O2能夠增強裸燕麥對Cd脅迫的耐性。

光合作用是植物生長發(fā)育所需物質和能量的重要來源，也是對Cd脅迫最為敏感的生理過程[4-5]。葉綠素熒光參數(shù)反映植物對光能吸收、傳遞、耗散和分配的特性。其中Fv/Fm代表PSⅡ原初光化學效率；ΦPSⅡ反映PSⅡ實際光化學效率，其值大小與光系統(tǒng)反應中心激發(fā)能捕獲效率和開放程度有關[25]。張玲等[18]研究表明，100 μmol·L-1Cd脅迫下根施5 mmol·L-1H2O2對裸燕麥幼苗的Fv/Fm和ΦPSⅡ沒有影響。本研究表明，噴施5 mmol·L-1H2O2對正常條件下的裸燕麥幼苗葉片F(xiàn)v/Fm和ΦPSⅡ影響不大，但緩解了50 mg·L-1Cd2+脅迫誘導的Fv/Fm和ΦPSⅡ的下降幅度(表3)。表明噴施H2O2能夠減輕Cd脅迫對裸燕麥葉片PSⅡ反應中心的光抑制程度，從而提高PSⅡ電子傳遞速率和光能轉換效率。這與外源H2O2可提高干旱脅迫下歐薄荷[12]和鎳脅迫下芥菜[16]光合活性的研究結果一致。

qP是天線色素吸收的光能用于光化學反應的份額[23]，而NPQ是天線色素吸收的光能以熱能耗散的部分[25]。NPQ主要包括調節(jié)性能量耗散Y(NPQ)和非調節(jié)性能量耗散Y(NO)，Y(NPQ)與高能態(tài)猝滅有關，而Y(NO)與光抑制有關[27]。本試驗中，Cd脅迫下裸燕麥幼苗qP下降的同時，NPQ和Y(NPQ)提高(表2)。說明Cd脅迫降低PSⅡ光化學效率的同時，啟動了過剩激發(fā)能耗散機制以免光合機構遭受進一步破壞。但是Cd脅迫下光化學活性下降引起的過剩光能最終還是造成了光合機構的光抑制破壞，表現(xiàn)為Y(NO)的上升(表2)。葉黃素循環(huán)是植物葉綠體中類囊體膜上的葉黃素組分V、A和Z相互轉化的現(xiàn)象，而NPQ的誘導與依賴跨類囊體膜質子梯度的葉黃素循環(huán)密切相關[21]。Cd脅迫下裸燕麥幼苗NPQ增加(表2)的同時，葉黃素循環(huán)組分V下降，而A、Z和脫環(huán)氧化狀態(tài)(A+Z)/(V+A+Z)提高(表1)。表明Cd脅迫下依賴葉黃素循環(huán)中V向A和Z轉化的熱耗散機制可能是裸燕麥耗散過剩光能的重要途徑。田武英等[28]研究發(fā)現(xiàn)，外源H2O2處理能夠提高菜豆(Phaseolusvulgaris)葉片的qP及ΦPSⅡ，而降低NPQ和Y(NPQ)。本研究結果表明，噴施5 mmol·L-1H2O2降低了正常條件下裸燕麥幼苗葉片的V含量，提高了Z含量和(A+Z)/(V+A+Z)(表1)，而對A含量及qP、NPQ、Y(NPQ)和Y(NO) (表2)沒有影響，但緩解了50 mg·L-1Cd2+脅迫誘導的V和qP的下降程度，降低了Cd脅迫下的A、Z、(A+Z)/(V+A+Z)、NPQ、Y(NPQ)和Y(NO)(表1、2)。說明外源H2O2主要是通過提高PSⅡ的光化學效率而非增強依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散來降低Cd脅迫對光合機構的光抑制破壞。其原因之一可能與H2O2能夠提高抗氧化防御能力，從而減輕Cd引發(fā)的氧化傷害[15，18]和葉綠體超微結構得到保護[11]等有關。

Cd脅迫既阻礙光合電子傳遞，又使PSⅡ供體側、受體側和反應中心遭受傷害[5]；保持PSⅠ和PSⅡ激發(fā)能的均衡分配是光合電子高效運轉和協(xié)調傳遞的保證[29]。本試驗中，Cd脅迫導致裸燕麥幼苗分配給PSⅠ的激發(fā)能α減少，而分配給PSⅡ的激發(fā)能β增加，致使表征兩光系統(tǒng)間激發(fā)能分配不平衡的偏離系數(shù)β/α-1增大(表3)。說明Cd脅迫使激發(fā)能在兩個光系統(tǒng)間的分配失衡。PSⅡ激發(fā)能的增加會誘導反應中心的失活和結構的破壞，從而阻止光合電子的傳遞，導致光合作用的下降[30]。本試驗中，用5 mmol·L-1H2O2噴施處理降低了50 mg·L-1Cd2+脅迫誘導的裸燕麥幼苗葉片β和β/α-1的增幅，提高了α(表3)。表明外源H2O2能夠通過調節(jié)雙光系統(tǒng)間激發(fā)能的均衡分配促進光合電子的協(xié)調傳遞。而外源H2O2對雙光系統(tǒng)間激發(fā)能均衡分配的調節(jié)又是其提高Cd脅迫裸燕麥幼苗吸收光能用于光化學反應份額P(表4)的重要因素，P值的升高將有利于PSⅡ過剩光能的減少，進而降低天線熱耗散的激發(fā)能份額D。在Cd脅迫導致PSⅡ反應中心失活甚至完全關閉的情況下，已傳遞到反應中心的激發(fā)能因不能用于光化學反應只能通過增加反應中心耗散份額Ex，從而誘導活性氧的大量產(chǎn)生并損傷葉綠素結構蛋白，造成ΦPSⅡ的下降[5]。噴施H2O2對Cd脅迫誘導的Ex升高顯著的緩解作用(表4)表明，外源H2O2可以通過降低PSⅡ非光化學反應耗散來緩解Cd脅迫對裸燕麥葉片反應中心的損傷。這與外源H2O2可緩解干旱對黃瓜葉綠體超微結構破壞的研究結果類似[11]。

植物根部吸收的Cd隨蒸騰作用向地上部發(fā)生轉運，為降低Cd轉運對生長發(fā)育和細胞代謝產(chǎn)生的不利影響，植物具有一系列抵御Cd毒害的機制。如通過腺體或質膜將Cd排出體外，或將Cd區(qū)室于液泡中鈍化[31]；或通過抑制Cd轉運體合成來限制Cd的轉運[3]；或與金屬硫蛋白(MTs)和植物螯合肽(PCs)等螯合將有毒Cd2+轉變?yōu)闊o毒Cd形態(tài)[32]。Arasimowicz-Jelonek等[33]研究表明，NO信號能夠緩解Cd脅迫對植物的毒害，但促進植物體Cd的積累。本研究結果表明，H2O2對Cd脅迫下裸燕麥幼苗地上部Cd含量沒有影響，卻提高了根系Cd含量及根系和地上部Cd積累量，降低了Cd由根系向地上部的轉運率(表5)。說明外源H2O2能夠增強植物根系對Cd的滯留和轉運限制作用，這可能也是其能夠降低Cd脅迫對裸燕麥生長和光化學活性抑制的重要因素。其原因可能與H2O2能夠促進根系細胞壁果膠、半纖維素、纖維素和木質素合成，從而使Cd在根系細胞壁沉積有關[34]；也可能是H2O2能夠提高根系非蛋白巰基(NPT)、PCs和谷胱甘肽轉硫酶(GST)活性[14]，使游離態(tài)Cd2+形成絡合物鈍化而解毒所致。植物對Cd脅迫的防御機制是包括一系列復雜信號轉導的生理生化過程，H2O2增強植物Cd耐性的諸多機制尚需進一步深入探究。

4 結 論

噴施5 mmol·L-1H2O2可緩解50 mg·L-1Cd2+脅迫對裸燕麥幼苗生長的抑制，提高Cd脅迫下裸燕麥葉片PSⅡ的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP及光系統(tǒng)Ⅰ激發(fā)能分配系數(shù)(α)和吸收光能光化學反應份額(P)，降低葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)(A+Z)/(V+A+Z)及NPQ、Y(NPQ)、Y(NO)、PSⅡ激發(fā)能分配系數(shù)(β)、雙光系統(tǒng)間激發(fā)能分配不平衡偏離系數(shù)(β/α-1)、吸收光能天線熱耗散份額(D)和PSⅡ反應中心非光化學耗散份額(Ex)。同時，噴施H2O2還提高了Cd脅迫下裸燕麥根系Cd含量及根系和地上部Cd積累量，降低了根系向地上部Cd的轉運率。表明外源H2O2可通過提高PSⅡ光化學效率及增強根系Cd滯留和限制Cd由根系向地上部轉運，增強裸燕麥耐鎘性。