于冬旭，高玉娟，楊立瑩，楊東光

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.血液內(nèi)科，b.中心血液實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為骨髓中髓樣細(xì)胞的增多和不受控制的生長及其在血液中的積聚。CML的標(biāo)志是費(fèi)城染色體，其由染色體9和22長臂之間的相互易位產(chǎn)生，該染色體易位導(dǎo)致Bcr-Abl表達(dá)，Bcr-Abl是具有組成型活化的Abl酪氨酸激酶的原癌融合蛋白。其通過激活下游信號(hào)蛋白促進(jìn)白血病的發(fā)生，從而增加細(xì)胞的存活和增殖[1]。這些信號(hào)蛋白包括RAS/促分裂原活化的蛋白激酶激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子[2]等。以伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)為代表的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)是治療CML的一線藥物，該藥能特異性阻斷ATP在Abl激酶上的結(jié)合位置，使酪氨酸殘基不能磷酸化，從而抑制Bcr-Abl陽性細(xì)胞的增殖，相對(duì)于干擾素、白消安、羥基脲等傳統(tǒng)治療藥物，IM可顯著提高CML治療效率及早期患者的生存率，但該藥物并不能治愈CML，且可能出現(xiàn)IM的耐藥，對(duì)晚期CML患者IM療效欠佳，不能阻止疾病的復(fù)發(fā)和進(jìn)展[3]。IM的耐藥機(jī)制復(fù)雜，按是否與Bcr-Abl相關(guān)可分為Bcr-Abl依賴性或Bcr-Abl非依賴性[4]?，F(xiàn)就CML IM耐藥機(jī)制及新治療進(jìn)展予以綜述。

1 IM耐藥機(jī)制

1.1Bcr-Abl依賴性耐藥機(jī)制 Bcr-Abl依賴性耐藥機(jī)制主要包括Bcr-Abl基因點(diǎn)突變、Bcr-Abl融合基因的擴(kuò)增、Bcr-Abl蛋白的過表達(dá)等，其中Bcr-Abl激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生點(diǎn)突變是最常見的耐藥原因[5]，而T315I突變是最頑固的點(diǎn)突變，占Bcr-Abl激酶結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變的15%[6]。IM主要作用于Bcr-Abl融合基因區(qū)域，若其作用位點(diǎn)發(fā)生突變，則藥物將不能與其結(jié)合從而導(dǎo)致下游異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，臨床表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的繼續(xù)增生克隆，因而產(chǎn)生耐藥[7]。同時(shí)，Bcr-Abl基因中的突變能干擾Bcr-Abl的激酶結(jié)構(gòu)域與抑制劑分子之間形成的關(guān)鍵氫鍵，削弱Bcr-Abl蛋白結(jié)合抑制劑分子ATP結(jié)合位點(diǎn)的能力。最常見的Bcr-Abl激酶區(qū)突變主要為以下4個(gè)簇區(qū)發(fā)生突變：P-環(huán)簇、T315近側(cè)簇、酶促反應(yīng)簇和A-環(huán)簇，其中P-環(huán)和T315I的突變作用最強(qiáng)且最常見，可完全阻斷IM與ATP的結(jié)合[8]。除Bcr-Abl激酶突變外，Bcr-Abl融合基因的擴(kuò)增和蛋白的過度表達(dá)也是導(dǎo)致IM耐藥的常見原因，其可使原有劑量的IM不足以控制病情，從而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。

1.2Bcr-Abl非依賴性IM耐藥機(jī)制

1.2.1白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)的存在 CML-LSCs或稱白血病起始細(xì)胞是所有CML細(xì)胞的共同祖先。LSCs的一些生長特性決定了其對(duì)TKIs的治療具有抵抗作用。①雖然Bcr-Abl蛋白賦予了CML-LSCs白血病的特征，但Bcr-Abl并非CML-LSCs賴以生存的唯一蛋白。在IM的作用下，CML-LSCs還可以通過其他信號(hào)維持存活。研究證實(shí)，盡管IM對(duì)CML患者靜止期和循環(huán)中干、祖細(xì)胞的Bcr-Abl蛋白活性具有抑制作用，卻無法清除CML-LSCs[9]。②CML-LSCs具有遺傳不穩(wěn)定性，隨著對(duì)CML治療的深入研究發(fā)現(xiàn)，CML-LSCs逐漸產(chǎn)生基因突變，形成CML的克隆演變，對(duì)現(xiàn)有治療方法產(chǎn)生抵抗[10]。雖然TKIs持續(xù)作用，但CML-LSCs仍可以維持存活狀態(tài)，并隨著克隆演變最終失控生長，這是CML發(fā)生非Bcr-Abl依賴式耐藥的根本原因[11]。因此，清除對(duì)治療不敏感的CML-LSCs，是治療 IM耐藥的關(guān)鍵[12]。

截至目前，研究者已發(fā)現(xiàn)多種CML-LSCs賴以生存的信號(hào)通路及其相應(yīng)的靶向性藥物。這些信號(hào)通路主要包括Bcr-Abl/PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路、Hh(Hedgehog)通路、Wnt通路、Bcl-6/p53通路等。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路經(jīng)常在許多人類癌癥中被激活，PIK3CA突變和人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因功能喪失可導(dǎo)致對(duì)靶向PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑治療的敏感性增加；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路與IM耐藥相關(guān)[13]。因此，鑒定靶向抑制劑可以為CML治療提供新策略。

Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是進(jìn)化上的保守途徑，其在調(diào)節(jié)涉及正常干細(xì)胞分化和增殖以及無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中適當(dāng)分離的各種發(fā)育和生理過程中起重要作用。然而，學(xué)者發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育期間Hh通路的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會(huì)引起各種先天缺陷及幾種腫瘤轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤[14]。此外，Hh通路在維持體細(xì)胞干細(xì)胞和多能細(xì)胞中起重要作用，它參與了肺、牙齒、肝臟、前列腺和膀胱中上皮干細(xì)胞的再生增殖，且這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與癌癥干細(xì)胞的維持相關(guān)。因此，通過抑制Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶向癌癥干細(xì)胞是一種可以有效改善癌癥患者臨床結(jié)果的潛在治療方法[14]。Hh通路是一條干細(xì)胞通路，但作為CML-LSCs的重要通路，Hh信號(hào)分子并不位于Bcr-Abl的下游，也不能被TKIs所抑制，提示對(duì)IM耐藥的患者，需聯(lián)合Hh靶向性抑制劑進(jìn)行治療。

自從Wnt信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)以后，許多針對(duì)Wnt信號(hào)通路及其抑制劑在惡性腫瘤治療方面的研究取得了令人滿意的成果。Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典的依賴β聯(lián)蛋白途徑和非經(jīng)典的不依賴β聯(lián)蛋白途徑，β聯(lián)蛋白是正常造血干細(xì)胞自我更新和生存所必需，Wnt/β聯(lián)蛋白通路在CML-LSCs的持續(xù)存在中具有重要作用[15]。

Bcl-6/p53通路對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性有調(diào)節(jié)作用。體外和體內(nèi)研究表明，費(fèi)城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞和IM耐藥的CML細(xì)胞均有Bcl-6蛋白的高表達(dá)；Bcl-6介導(dǎo)p53的上調(diào)，Bcl-6通過靶向p53誘導(dǎo)IM耐藥細(xì)胞的生長抑制和凋亡[16]。

此外研究發(fā)現(xiàn)，CML-LSCs表達(dá)的某些蛋白可作為其潛在的治療靶標(biāo)，如γ聯(lián)蛋白[17]、血紅素加氧酶-1[5]、蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5[18]等與IM耐藥密切相關(guān)。

1.2.2LSC的骨髓微環(huán)境 對(duì)于白血病、淋巴瘤等惡性血液病，癌細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)相互作用，且更有可能在骨髓微環(huán)境中產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境中的可溶性因子，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、CXC趨化因子配體12和白細(xì)胞介素-6可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的歸巢、存活和增殖，并引起可溶性因子介導(dǎo)的抗藥性[16]。CXC趨化因子配體12的激活是導(dǎo)致白血病細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵因素之一，其在造血干細(xì)胞歸巢過程中起重要作用，介導(dǎo)人和小鼠祖細(xì)胞的存活和增殖。骨髓微環(huán)境通過激活CXC趨化因子配體12/CXC趨化因子受體7通路和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化誘導(dǎo)CML細(xì)胞對(duì)IM治療的抗性[19]。

1.2.3多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物靶酶的過度表達(dá) IM的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，研究表明，多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物靶酶的過度表達(dá)可能與CML的IM耐藥有關(guān)[20]。其中，研究最深入的機(jī)制為由P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)和多藥耐藥相關(guān)蛋白-1介導(dǎo)的多藥耐藥。PGP由多藥耐藥基因(ATP結(jié)合盒B亞家族成員1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)編碼，并參與藥物吸收、分布、代謝和排泄。多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，如PGP、多藥耐藥相關(guān)蛋白家族、乳腺癌耐藥蛋白等，均能促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解細(xì)胞內(nèi)藥物外流或囊泡分離，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低或藥物分布改變。而以PGP和多藥耐藥相關(guān)蛋白-1介導(dǎo)的多藥耐藥為最佳研究對(duì)象[20]。

2 CML與IM耐藥治療

2.1Bcr-Abl依賴性耐藥的治療 針對(duì)不同的耐藥點(diǎn)突變，已靶向研發(fā)出二代、三代TKIs，它們不僅對(duì)IM耐藥的點(diǎn)突變分別起效，且激酶活性更高，抑制能力更強(qiáng)。其中，二代TKIs(尼洛替尼、達(dá)沙替尼和布素替尼)對(duì)除T315I外的一系列Bcr-Abl突變均有效。三代TKIs(扎那替尼)則可靶向性抑制含有T315I突變的Bcr-Abl陽性CML細(xì)胞。雖然Bcr-Abl單突變的CML患者對(duì)扎那替尼具有初始反應(yīng)，但晚期患者對(duì)該藥的反應(yīng)有限，因?yàn)檫B續(xù)使用TKIs會(huì)導(dǎo)致Bcr-Abl激酶結(jié)構(gòu)域復(fù)合突變，這種突變對(duì)扎那替尼耐藥[21]。雖然新一代的TKIs可分別對(duì)各自耐藥突變起效，但也能造成患者出現(xiàn)TKIs多藥耐藥現(xiàn)象[22]。因此，耐藥患者缺乏有效的治療方案，死亡率極高。

2.2Bcr-Abl非依賴性耐藥的治療 研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚[23]及靶向表皮生長因子受體激酶底物8(epidermal growth factor receptor kinase substrate 8，EPS8)[24]可以作用于Bcr-Abl/PI3K/Akt/mTOR通路。Tan等[23]通過體內(nèi)體外聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了丙泊酚及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞系、患者細(xì)胞和小鼠模型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚與TKIs聯(lián)合應(yīng)用對(duì)CML細(xì)胞的作用具有特異性，且不影響正常細(xì)胞，故其可能成為IM治療的新選擇。EPS8被鑒定為一種致癌基因且在廣譜實(shí)體瘤中起重要作用，其與急性白血病患者的不良預(yù)后或化學(xué)抗性相關(guān)。Huang等[24]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，EPS8通過Bcr-Abl/PI3K/Akt/mTOR途徑調(diào)節(jié)Bcr-Abl陽性細(xì)胞的增殖、凋亡和化學(xué)敏感性，EPS8的敲低減少了BALB/c裸鼠中的K562細(xì)胞增殖。因此，單獨(dú)靶向EPS8或與TKI組合可能是一種新治療策略。

目前，研究的Hh通路抑制劑均以Smo為靶點(diǎn)，包括GDC-0449、LDE225、PF-04449913及BMS-833923等，Hh通路抑制劑的藥理活性較Smo的天然抑制劑環(huán)巴胺提高。且研究發(fā)現(xiàn)，Hh通路抑制劑與TKIs聯(lián)合應(yīng)用，在治療CML的臨床前研究中獲得了滿意療效[25]。此外在急性髓系白血病中，環(huán)巴胺能恢復(fù)LSCs對(duì)化療藥物的敏感性，提示這類藥物也可能作為逆轉(zhuǎn)耐藥藥物[26]。研究證實(shí)，三氧化二砷對(duì)Hh通路具有顯著的抑制作用，其主要是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2的信使RNA表達(dá)，并同時(shí)上調(diào)Hh通路抑制因子ptch的信使RNA表達(dá)發(fā)揮作用[27]?？梢姡趸閼?yīng)用于IM耐藥的CML患者將會(huì)顯示更大的藥用價(jià)值和更廣闊的應(yīng)用前景。

目前針對(duì)Wnt信號(hào)通路，沒有直接拮抗β聯(lián)蛋白的藥物，只有一些小分子Wnt通路抑制劑，如AV65、FH535、吲哚美辛等，它們可以減少β聯(lián)蛋白表達(dá)并誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡。因此，新的Wnt信號(hào)通路抑制劑有望為CML的治療提供更多選擇。

研究發(fā)現(xiàn)，高三尖杉酯堿可以作用于Bcl-6/p53通路，不同細(xì)胞經(jīng)高三尖杉酯堿處理后，Bcl-6的表達(dá)均有中度下調(diào)；而CML患者的Bcl-6表達(dá)水平明顯高于正常人，且Bcl-6在CML急變期患者中的表達(dá)水平明顯高于CML慢性期患者[16]。高三尖杉酯堿的抗白血病機(jī)制不同于IM，其是用于IM耐藥患者的最有效藥物之一。同時(shí)，高三尖杉酯堿是蛋白質(zhì)翻譯的抑制劑，它通過影響核糖體的A位點(diǎn)來阻止蛋白質(zhì)的合成，且可以通過阻斷Bcl-6/p53通路抑制IM抗性細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為IM耐藥及不耐藥患者的治療提供了新選擇[16]。

組蛋白去乙?；敢种苿┦且活惪鼓[瘤藥物，它通過增強(qiáng)組蛋白賴氨酸殘基的乙?；饔梅潘山M蛋白核心表面被抑制基因的轉(zhuǎn)錄，其可以選擇性殺傷惡性腫瘤，同時(shí)保留正常細(xì)胞。此外，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑與TKIs聯(lián)合應(yīng)用，可消除CML和急性骨髓增生性疾病中靜止的LSCs。雖然口服組蛋白去乙?；敢种苿┛梢韵鼵ML中的靜息LSCs，但對(duì)其殺死LSCs的潛在機(jī)制尚不清楚。Jin等[17]通過用生物素標(biāo)記的探針捕獲，證實(shí)組蛋白去乙?；敢种苿?duì)γ聯(lián)蛋白的抑制作用導(dǎo)致CML-LSCs的消除，故γ聯(lián)蛋白可能是LSCs的新型治療靶點(diǎn)。Wei等[5]發(fā)現(xiàn)，血紅素加氧酶-1通過調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；傅谋磉_(dá)參與CML細(xì)胞中耐藥性的發(fā)展，這可能是CML治療的新靶點(diǎn)。Jin等[18]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CML細(xì)胞中Bcr-Abl和蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5之間存在正反饋環(huán)，且在人CML-LSCs中觀察到蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5的過表達(dá)。另有研究表明，組蛋白精氨酸殘基的表觀遺傳甲基化修飾是控制LSCs自我更新的調(diào)節(jié)機(jī)制，且蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5可能為LSCs的潛在治療靶標(biāo)[26]。

針對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、CXC趨化因子配體12和白細(xì)胞介素-6等骨髓微環(huán)境中的可溶性因子，Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素A通過干擾CXC趨化因子配體12/CXC趨化因子受體7激活和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化來增強(qiáng)IM的效應(yīng)。因此，千層紙素A可能是增強(qiáng)IM效應(yīng)和逆轉(zhuǎn)耐藥性的潛在藥物，其為IM耐藥的治療帶來新選擇。

靶向PGP逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥性是目前研究最廣泛的策略之一。雖然已對(duì)PGP抑制劑進(jìn)行了四代研究，但由于其抑制能力不強(qiáng)，故沒有一種藥物應(yīng)用于臨床。而NFV(Nelfinavir)可以避免這一缺點(diǎn)，它是一種蛋白酶抑制劑，被用于治療艾滋病，可能是一種潛在的PGP抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NFV通過降低細(xì)胞內(nèi)ATP含量與ATP和PGP結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)以抑制K562/ADR細(xì)胞PGP的功能，其與ADR結(jié)合導(dǎo)致活性氧類增加，阻斷胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以增加細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[28]。Germacrone是一種萜類化合物，其已被報(bào)道可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥。Pan等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Germacrone可通過抑制多藥耐藥1基因/PGP表達(dá)，逆轉(zhuǎn)人慢性粒細(xì)胞白血病K562/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，提示其可能是一種新的CML化療多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。

3 小 結(jié)

CML是一種起源于造血干細(xì)胞水平的惡性克隆性疾病，隨著IM的問世，大部分CML患者得到治愈，但仍有一些患者出現(xiàn)耐藥，且達(dá)到完全分子生物學(xué)緩解的患者，停用IM也存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。目前針對(duì)不同突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的二代和三代TKIs，雖然可以分別對(duì)各自耐藥突變起效，但也能造成患者出現(xiàn)TKIs多藥耐藥現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，TKI不能清除CML-LSCs，大部分應(yīng)用TKI治療的CML患者Bcr-Abl信使RNA持續(xù)存在，但其具體耐藥機(jī)制尚不明確[30]。未來，需進(jìn)一步探究靶向CML-LSCs的耐藥機(jī)制，根據(jù)不同的耐藥機(jī)制研發(fā)更多新藥物，從而為治愈CML提供更多的治療選擇。