六種國產(chǎn)糞便隱血檢測(cè)試劑的診斷性能評(píng)價(jià)*

李文東，白海燕，李淑蓮，林惠玲，諶泰春，徐士蘭，張惠林

(1.廈門市湖里區(qū)婦幼保健院，福建廈門 361006；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，福建廈門 361004)

糞便隱血是指消化道出血，紅細(xì)胞已被消化破壞，肉眼和顯微鏡下均不能證實(shí)的出血[1]。常見糞便隱血檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)原理不同有化學(xué)法和免疫法兩種定性檢測(cè)法，各有其優(yōu)點(diǎn)和不足[2]?；瘜W(xué)法(如匹拉米洞法、鄰甲苯胺法、還原酚酞法等)易受食物、藥物等干擾因素的影響；免疫法(如酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法等)敏感度高、特異性好，不受食物因素的影響，無需禁食[3]，但可能因血紅蛋白變性而出現(xiàn)假陰性結(jié)果[4]。目前國內(nèi)外尚無標(biāo)準(zhǔn)化的糞便隱血試驗(yàn)的性能評(píng)估方法，面對(duì)性能指標(biāo)信息有限、品種繁多和應(yīng)用廣泛的糞便隱血試劑，臨床醫(yī)生與檢驗(yàn)人員充滿困惑與迷茫。本研究綜合評(píng)價(jià)六種臨床常用國產(chǎn)商品化糞便隱血試劑的檢測(cè)性能，包括最低檢測(cè)限、分析特異性(包括交叉反應(yīng)性和干擾物質(zhì))和高濃度血紅蛋白檢測(cè)能力等，為探討糞便隱血試劑的性能評(píng)估方法提供借鑒，并為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇合適的糞便隱血試劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 臨床糞便樣本：120例新鮮糞便樣本來自廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科就診患者，包括消化道出血53例，男性33例，女性20例，中位年齡56.60±14.62歲；消化道腫瘤67例，男性46例，女性21例，中位年齡59.76±11.45歲。另有80例新鮮糞便標(biāo)本來自健康體檢者，其中男性54例，女性26例，中位年齡57.76±13.40歲。采用清潔干燥不吸水帶蓋容器采集新鮮糞便標(biāo)本，立即送檢，于收集后1 h內(nèi)完成檢測(cè)。所有樣本的使用均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者本人的知情同意，簽署知情同意書。

1.1.2 最低檢測(cè)限樣本：采用無菌蒸餾水將40 mg/ml的人血紅蛋白(批號(hào)F16062401，廈門市波生生物技術(shù)有限公司提供)稀釋至25，50，75，100，150，200，400和1 000 ng/ml等8個(gè)濃度。所有樣本均在使用前臨時(shí)配制，確?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 高值血紅蛋白樣本：用無菌蒸餾水將40 mg/ml的人血紅蛋白(批號(hào)F16062401，廈門市波生生物技術(shù)有限公司提供)稀釋至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 mg/ml和40 mg/ml共12個(gè)濃度。所有樣本均在使用前臨時(shí)配制，確?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 特異性試驗(yàn)樣本：在200 ng/ml的血紅蛋白溶液中加入不同量的維生素C，使最后的維生素C濃度分別為0.01，0.05，0.1和0.3 mg/ml。所有樣本均在使用前臨時(shí)配制，確?，F(xiàn)配現(xiàn)用。將牛、狗、雞、豬、羊以及兔的血紅蛋白分別配制成濃度為0.5 mg/ml的樣本，將辣根過氧化物酶(HRP)配制成2 mg/ml的樣本[5]。

1.2 試劑 六個(gè)國產(chǎn)糞便隱血檢測(cè)試劑的廠家包括：廈門市波生生物技術(shù)有限公司(膠體金法，批號(hào)為H17062401，簡(jiǎn)稱波生)、艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司(膠體金法，批號(hào)為2017030350，簡(jiǎn)稱艾博)、英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司(膠體金法，批號(hào)為20170610，簡(jiǎn)稱新創(chuàng))、北京萬華普曼生物工程有限公司(金試紙條，批號(hào)為17070023，簡(jiǎn)稱萬華)、廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司(免疫層析法，批號(hào)為W03070704S，簡(jiǎn)稱萬孚)和珠海貝索生物技術(shù)有限公司(匹拉米洞半定量檢測(cè)法，批號(hào)為217041，簡(jiǎn)稱貝索)。以上各種糞便隱血試劑均按照各試劑說明書妥善保存，嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書操作并判斷結(jié)果。

1.3 方法

1.3.1 室內(nèi)質(zhì)量控制：每批檢測(cè)開始前檢測(cè)自制質(zhì)控品，質(zhì)控品結(jié)果為陽性才進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2 樣本檢測(cè)：所有樣本(包括臨床樣本以及上述所有配制樣本)，均采用六種國產(chǎn)糞便隱血檢測(cè)試劑分別檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，操作方法嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行，記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 六種國產(chǎn)糞便隱血試劑的就診患者和健康體檢人員的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，運(yùn)用SPSS Statistics 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六種國產(chǎn)糞便隱血檢測(cè)試劑最低檢測(cè)限比較 見表1。本研究采用六種國產(chǎn)糞便隱血試劑分別檢測(cè)不同濃度的人血紅蛋白溶液，化學(xué)法的檢測(cè)試劑(貝索)的最低檢測(cè)限為25 ng/ml，其它五種免疫法檢測(cè)試劑(艾博、波生、新創(chuàng)、萬華和萬孚)的檢測(cè)限分別為50，100，150，200和200 ng/ml。

表1 六種國產(chǎn)糞便隱血試劑最低檢測(cè)限

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

2.2 六種國產(chǎn)糞便隱血檢測(cè)試劑對(duì)高值血紅蛋白檢測(cè)高限比較 見表2。

表2六種國產(chǎn)糞便隱血試劑高濃度血紅蛋白檢測(cè)結(jié)果

血紅蛋白濃度(mg/ml)試劑廠家及檢測(cè)結(jié)果貝索波生艾博新創(chuàng)萬華萬孚123456789102040++++++++++++++++++++++--++++++++++--+++++++-----+++---------+++---------

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

貝索試劑(化學(xué)法)檢測(cè)40 mg/ml人血紅蛋白呈陽性，波生和艾博兩種便隱血試劑檢測(cè)人血紅蛋白高值為10 mg/ml，新創(chuàng)試劑可檢測(cè)人血紅蛋白高值為7 mg/ml，萬華和萬孚兩種試劑的檢測(cè)高值為3 mg/ml。除貝索試劑外，當(dāng)血紅蛋白濃度高于各試劑檢測(cè)高值時(shí)，檢測(cè)結(jié)果呈陰性。

2.3 六種國產(chǎn)糞便隱血試劑檢測(cè)特異性分析 本研究也針對(duì)糞便隱血試劑的檢測(cè)特異性進(jìn)行評(píng)估，分別測(cè)試動(dòng)物血、辣根過氧化物酶和維生素C這三種干擾物質(zhì)對(duì)糞便隱血試劑檢測(cè)結(jié)果的影響。待檢樣本中加入不同動(dòng)物來源的血紅蛋白和辣根過氧化物酶干擾物質(zhì)后，除貝索檢測(cè)六種500 μg/ml的動(dòng)物血紅蛋白均呈陽性，萬孚和新創(chuàng)兩種糞便隱血試劑檢測(cè)500 μg/ml兔血紅蛋白樣本時(shí)出現(xiàn)陽性結(jié)果外，其余均不與牛、狗、雞、豬、羊和兔的血紅蛋白以及HRP發(fā)生交叉反應(yīng)，見表3。

表3干擾因素下六種國產(chǎn)糞便隱血試劑的檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本(μg/ml)檢測(cè)試劑貝索萬孚新創(chuàng)艾博波生萬華牛血(500)狗血(500)雞血(500)豬血(500)羊血(500)兔血(500)HRP(2000)++++++------+------+----------------------

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

維生素C是糞便隱血試驗(yàn)假陰性結(jié)果的影響因素，在我們的實(shí)驗(yàn)中，200 ng/ml血紅蛋白樣本中維生素C含量在0.01～0.3 mg/ml范圍，波生、萬孚、貝索和艾博四種試劑檢測(cè)結(jié)果不變；而新創(chuàng)和萬華兩種糞便隱血試劑在維生素C含量高于0.1 mg/ml時(shí)，檢測(cè)結(jié)果改變，結(jié)果由陽性變?yōu)殛幮?。提示維生素C含量高于0.1 mg/ml時(shí)將導(dǎo)致新創(chuàng)和萬華檢測(cè)試劑出現(xiàn)假陰性結(jié)果，見表4。

表4維生素C對(duì)六種國產(chǎn)糞便隱血試劑的影響

試劑廠家維生素C濃度(mg/ml)及檢測(cè)結(jié)果00.010.050.10.3波生萬孚貝索艾博新創(chuàng)萬華++++++++++++++++++++++--++++--

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

2.4 六種國產(chǎn)糞便隱血試劑臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 采用六種國產(chǎn)糞便隱血試劑分別檢測(cè)120例消化內(nèi)科就診患者(試驗(yàn)組)和80例健康體檢人員(對(duì)照組)新鮮糞便標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果見表5。120例消化內(nèi)科患者的六種試劑陽性率在23.3%～60.0%區(qū)間，依次為貝索60.0%，艾博46.7%，波生42.5%，新創(chuàng)40.0%，萬華33.3%和萬孚23.3%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示試驗(yàn)組六種方法的檢測(cè)陽性率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；80例健康體檢者的檢測(cè)陽性率在1.3%～2.5%之間，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示對(duì)照組六種方法的檢測(cè)陽性率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 六種國產(chǎn)糞便隱血試劑臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

糞便隱血試驗(yàn)對(duì)消化道出血的診斷有重要價(jià)值，現(xiàn)在常作為消化道惡性腫瘤早期診斷的一個(gè)篩選指標(biāo)[6～8]。與確診消化道出血的金標(biāo)準(zhǔn)消化道內(nèi)窺鏡檢查相比，糞便隱血試驗(yàn)具有非侵入性、標(biāo)本留取方便、檢測(cè)快速、成本低廉等優(yōu)勢(shì)而容易被患者接受[9，10]。目前市面上用于糞便隱血檢測(cè)的方法主要是化學(xué)法和免疫法，無論是化學(xué)法或免疫法檢測(cè)試劑，在臨床應(yīng)用前都需要對(duì)廠家聲明的性能參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，至少應(yīng)包括：檢出限、符合率，如為定量方法應(yīng)驗(yàn)證精密度(包括重復(fù)性和中間精密度)[11]。本項(xiàng)目對(duì)六種國產(chǎn)糞便隱血試劑，包括五種免疫法試劑和一種化學(xué)法檢測(cè)試劑進(jìn)行了檢出限評(píng)價(jià)。化學(xué)法試劑(貝索)的最低檢測(cè)限為25 ng/ml，五種免疫法試劑(艾博、波生、新創(chuàng)、萬華和萬孚)的檢測(cè)限分別為50，100，150，200和200 ng/ml，六種試劑的最低檢測(cè)限均符合各廠家的最低檢測(cè)限聲明。目前的隱血檢測(cè)方法敏感度高，胃腸道少量出血可檢出陽性結(jié)果，有研究發(fā)現(xiàn)牙齦出血也可能致糞便隱血陽性[2，12]，因此對(duì)于無癥狀患者陽性結(jié)果解釋需慎重，必要時(shí)進(jìn)行隨訪復(fù)查。

化學(xué)法糞便隱血試劑是基于血紅蛋白具有過氧化物酶活性的測(cè)定方法，以匹拉米洞方法為代表，利用匹拉米洞為呈色指示劑，在酸及過氧化氫溶液作用下，與血紅蛋白作用，產(chǎn)生紫藍(lán)而后呈現(xiàn)紫紅的顏色。此法特異性差，無法區(qū)分血紅蛋白來源于消化道出血或來源于食物，甚至有些藥物的使用也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。而免疫法糞便隱血試劑，主要是檢測(cè)人體血紅蛋白抗原，具有較強(qiáng)的特異性和靈敏性，一般不受食物和藥物等因素的影響，基于這種優(yōu)勢(shì)，免疫法采用抗人血紅蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，特異地與糞便中人血紅蛋白結(jié)合，利用膠體金等標(biāo)記進(jìn)行顯色測(cè)定，已廣泛應(yīng)用于臨床。但也有不足之處，可能因血紅蛋白變性或降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果[4，13]。本研究分別研究動(dòng)物血(牛、狗、雞、豬、羊和兔)、辣根過氧化物酶和維生素C三類常見的干擾物質(zhì)對(duì)糞便隱血試劑檢測(cè)人血紅蛋白的影響。貝索試劑(化學(xué)法)在檢測(cè)不同動(dòng)物(牛、狗、雞、豬、羊和兔)來源的血紅蛋白時(shí)均產(chǎn)生假陽性結(jié)果。萬孚和新創(chuàng)兩種糞便隱血試劑檢測(cè)500 μg/ml的兔血紅蛋白樣本時(shí)出現(xiàn)陽性結(jié)果，但對(duì)HRP檢測(cè)無反應(yīng)，波生、萬華和艾博三種糞便隱血試劑對(duì)500 μg/ml的牛、狗、雞、豬、羊和兔的血紅蛋白以及HRP檢測(cè)無反應(yīng)。對(duì)于抗維生素C的干擾能力，波生、萬孚、貝索、艾博的試劑優(yōu)于萬華和新創(chuàng)。

糞便隱血試驗(yàn)是臨床糞便常規(guī)檢測(cè)中的一個(gè)重要的檢測(cè)項(xiàng)目，廣泛應(yīng)用于消化道、胃腸道病變等內(nèi)科疾病的診斷中，對(duì)消化道出血的診斷具有極其重要的價(jià)值[14]。如何選擇高性能的糞便隱血試驗(yàn)，是臨床和檢驗(yàn)人員共同關(guān)注的問題。本文平行對(duì)比分析六種檢測(cè)方法在臨床中的應(yīng)用，結(jié)果顯示，六種方法的檢測(cè)陽性率在23.3%～60.0%，其差異較大(P<0.05)。即使同為免疫法試劑，其檢測(cè)陽性率也有差異(23.3%～46.7%)。診斷試劑所選用的抗體、試劑的稀釋液和試劑制作工藝不同，都會(huì)影響試劑的性能[3]。即使是同一個(gè)基因工程抗原，用在不同的公司產(chǎn)品中，其特異性也可能不同，這是目前基因工程抗原用于實(shí)驗(yàn)診斷的最大問題。因此，為了提高診斷試劑檢測(cè)的質(zhì)量，開展由衛(wèi)生主管部門主導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量控制，提升解決不同產(chǎn)品檢測(cè)靈敏性差異較大的短板，是非常重要的[15]。建議選用某種診斷試劑產(chǎn)品前應(yīng)該做好臨床評(píng)估，建立可溯源性的診斷試劑定量檢測(cè)體系。

本研究存在一定的局限性，首先是我們僅對(duì)六種糞便隱血試劑一個(gè)批次的產(chǎn)品進(jìn)行性能評(píng)估，不能反映不同批次的產(chǎn)品性能。此外，本研究納入的臨床糞便樣本，并未全部進(jìn)行消化道出血的金標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)窺鏡檢查，因此無法評(píng)估其診斷效能，包括檢測(cè)敏感度和特異度。而且，本研究也僅對(duì)同一批樣本的陽性率進(jìn)行了比較，未對(duì)不符合的樣本進(jìn)行追蹤。目前臨床檢驗(yàn)中心尚未開展糞便隱血的實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評(píng)，市面上沒有相關(guān)的糞便隱血的標(biāo)準(zhǔn)品用于質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)室多采用自制的質(zhì)控品用于日常工作的質(zhì)量控制[2]，本研究也僅采用人血紅蛋白來檢測(cè)試劑的最低檢測(cè)限和最高值血紅蛋白檢測(cè)能力，有條件時(shí)增加與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較的結(jié)果，建立主管部門牽頭的完善質(zhì)量評(píng)估體系，將是解決當(dāng)前糞便隱血試劑質(zhì)量良莠不齊的當(dāng)務(wù)之急。