陳柄全,彭 漪,肖 軼,彭智勇,趙吉玲,余國龍

(中南大學湘雅醫(yī)院心內科，長沙 410008)

間充質干細胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)具有自我更新及多向分化潛能，可促進損傷組織再生修復[1]；除此之外，MSCs具有重要的免疫調控作用[2-3]，其免疫調控機制復雜，尚未完全明確，但MSCs分化和免疫調節(jié)的能力已使MSCs移植成為臨床上治療炎癥和自身免疫性疾病的熱點。有研究證實，MSCs對機體的炎癥反應具有重要調控作用，主要機制是通過影響參與炎癥反應的免疫細胞增殖、分化和炎性因子分泌[4]。在炎癥過程中，單核細胞及分化為組織局灶的巨噬細胞，是參與體內炎癥反應的主要功能細胞。研究顯示[5]，單核細胞/巨噬細胞參與包括急性心肌梗死等組織炎癥反應過程中促炎性損傷、抗炎反應和組織修復的多重作用，MSCs主要通過調節(jié)單核細胞/巨噬細胞的表型和功能，促致炎性M1亞型單核細胞/巨噬細胞向抗炎性M2亞型轉化，可產(chǎn)生抑制炎性損傷、促進炎性組織修復的效應，從而調控單核細胞/巨噬細胞介導的炎癥反應。現(xiàn)就MSCs調控單核細胞/巨噬細胞介導炎癥反應效應與機制的研究進展進行綜述，以進一步認識MSCs移植產(chǎn)生治療作用的機制。

1 MSCs生物學特征與免疫調控

MSCs被認為是一種多功能干細胞，能夠分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉等多種組織細胞。MSCs主要來源于骨髓，還來源于成人組織，如臍帶、脂肪、肝臟、肺、肌肉以及腎臟等。1999年Pittenger等[6]發(fā)現(xiàn)MSCs多項分化的潛能后才得到學界的廣泛關注。MSCs的重要生物學特征是低水平表達人類白細胞抗原 Ⅰ 類分子和誘導效應T細胞所需CD40、CD40配體、CD80或CD86表達，由此，MSCs被認為是免疫豁免的[7-8]。這一特征也是MSCs在人類白細胞抗原不相容個體間移植不發(fā)生排斥反應的機制，也決定MSCs移植治療的安全性和有效性。

已有研究證實，MSCs對先天性免疫及獲得性免疫均可產(chǎn)生調控作用[9-11]。國外研究證實，在獲得性免疫反應中，MSCs在體內和體外可有效地抑制T細胞增殖，并誘導T細胞分裂停滯[9]，抑制B細胞終末分化[10]。有研究發(fā)現(xiàn)在先天性免疫反應中，MSCs可以通過吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)機制抑制自然殺傷細胞[11]。國內外多項實驗研究發(fā)現(xiàn)，MSCs促致炎性M1亞型單核細胞/巨噬細胞向抗炎性M2亞型轉化，可產(chǎn)生抑制炎性損傷、促進炎性組織修復的效應[12-13]。

2 單核細胞/巨噬細胞M1/M2型及轉化

單核細胞/巨噬細胞在非特異性免疫和特異性免疫中發(fā)揮重要作用，已有研究表明單核細胞/巨噬細胞與大多數(shù)急慢性炎性疾病有關[14]，單核細胞/巨噬細胞除參與炎癥反應和防御功能外，還具有組織修復、炎癥消退、代謝調節(jié)等功能[15-16]，而單核細胞/巨噬細胞功能與周圍微環(huán)境有關。微環(huán)境中生物物質(如細胞因子、微生物、微生物代謝產(chǎn)物和其他調節(jié)劑，包括核苷酸衍射物、糖皮質激素、感染)可以導致單核細胞/巨噬細胞向不同的方向極化，從而發(fā)揮不同功能[15]。Stein等[17]研究發(fā)現(xiàn)使用白細胞介素(interleukin,IL)4可上調巨噬細胞甘露糖受體，抑制巨噬細胞炎性細胞因子釋放；而γ干擾素(interferon-γ，INF-γ)可抑制巨噬細胞甘露糖受體表達。2013年，兩種功能及表型相反單核細胞/巨噬細胞被分別命名為經(jīng)典活化的單核細胞/巨噬細胞(M1型)和交替活化型單核細胞/巨噬細胞(M2)[15，18]。M1型單核細胞/巨噬細胞可以通過與脂多糖和INF-γ刺激得到，其表面白細胞分化抗原為CD86、CD11c，M1型單核細胞/巨噬細胞主要的生物特性是殺菌活性強，產(chǎn)生多種促炎性介質，包括誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-12和蛋白水解酶[13]，構成對病原體的第一道防線。M2單核細胞/巨噬細胞主要的生物特性是促進炎癥吸收與消退，產(chǎn)生多種抑炎介質，促進炎性組織修復[13]。其細胞表面抗原為CD206、CD163，可以通過IL-4刺激誘導產(chǎn)生，其細胞高度表達精氨酸酶1、CC趨化因子配體24、CC趨化因子配體17、IL-4、IL-10等細胞因子[14，19]。在炎癥過程中，M1和M2型可在不同條件下會相互轉化，如Nahrendorf等[20]首次發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死過程中會出現(xiàn)巨噬細胞隨著時間的推移發(fā)生M1/M2亞型的轉化。此后，實驗研究進一步證實[21]，在急性心肌梗死炎癥浸潤開始3 d以M1型巨噬細胞為主，第3天達到最高峰，分泌促炎的細胞因子IL-1、IL-6、IL-8；心肌梗死第3天后，逐漸發(fā)生M1型巨噬細胞對M2型的轉化，5～7 d M2比例逐漸超過M1，持續(xù)直至15 d左右，分泌抑炎的細胞因子IL-10、成纖維細胞生長因子/轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)，協(xié)助心肌梗死后的炎癥修復過程。

3 MSCs在體外調節(jié)巨噬細胞免疫表型

在體外環(huán)境下，將MSCs與單核/巨噬細胞直接共培養(yǎng)可以改變單核/巨噬細胞的免疫表型，Kim和Hematti[12]與Abumaree等[13]首先在實驗中將人單核細胞加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，成功地將單核細胞定向分化為呈“煎蛋樣”的M1型巨噬細胞，再與MSCs共培養(yǎng) 3 d，細胞逐漸變?yōu)槌省凹氶L紡錘樣”且吞噬活性明顯增加的M2型巨噬細胞。同時流式鑒定也發(fā)現(xiàn)其CD14、CD36、CD163、CD204、CD206等M2型表型增加，相應CD40、CD80和CD86等M1型巨噬細胞表型降低。其培養(yǎng)的細胞上清酶聯(lián)免疫吸附檢測發(fā)現(xiàn)促炎性細胞因子IL-1β、IL-12和巨噬細胞炎性蛋白1α分泌減少，而抗炎細胞因子IL-10顯著升高。上述學者的研究表明,MSCs可以在體外改變巨噬細胞的形態(tài)、炎性因子、免疫表型，使其從分泌促炎的作用為主的細胞因子M1型變成為分泌抑炎促進炎癥修復的細胞因子的M2型。研究還發(fā)現(xiàn),這種轉化效應是可逆的，如將共培養(yǎng)后的M2型巨噬細胞，再次加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子條件培養(yǎng)基后其M2的表型則顯著降低。

4 MSCs在體內調節(jié)巨噬細胞免疫表型

4.1MSCs調控心肌梗死巨噬細胞介導炎癥反應 MSCs移植對急性心肌梗死中有肯定的療效，但機制并不明確，巨噬細胞在其中發(fā)揮重要作用。Ben-Mordechai等[22]證實大鼠心肌梗死后，通過藥物耗竭巨噬細胞，反而增加心肌梗死的面積和死亡率，加速心室重構，心功能不全，而這些負面結果可以被MSCs移植所減弱，與空白對照組相比，MSCs移植治療可顯著提高梗死心肌中F4/80+、CD206+的M2巨噬細胞百分比。Dayan等[23]通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支制備心肌梗死模型，對大鼠心肌梗死后模型心肌注射MSCs。結果發(fā)現(xiàn)與安慰劑對照組相比，MSCs治療組大鼠心肌纖維化面積顯著減少，左心室射血分數(shù)顯著增高。免疫熒光分析MSCs治療組心肌中檢測到Arg1(M2標記)強表達。上述研究表明，MSCs可以通過調節(jié)巨噬細胞介導的炎癥反應抑制心肌梗死后的纖維化，改善心功能，促進炎癥修復。

4.2MSCs調節(jié)腎病巨噬細胞介導的炎癥反應 多項研究表明MSCs對多種腎炎有顯著治療作用[24-25]。Li等[26]觀察骨髓MSCs治療糖尿病腎病大鼠療效，結果顯示與空白對照組比較，骨髓MSCs治療組大鼠存活率高、腎功能改善，且腎臟病理發(fā)現(xiàn)腎小球基質沉積和腎小球硬化明顯減少。免疫組織化學定量測定發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs治療組大鼠腎臟組織促炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1蛋白表達水平下降，而抑炎性表皮生長因子表達水平明顯增高。有研究表明MSCs可以通過免疫調節(jié)和旁分泌作用抑制糖尿病大鼠腎促炎巨噬細胞浸潤和炎性細胞因子表達，促進腎臟組織免疫微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而改善糖尿病腎病病理結構和腎功能[24-25]。

4.3MSCs調節(jié)肺部疾病巨噬細胞介導炎癥反應 MSCs可以在肺炎中調節(jié)巨噬細胞免疫表型抑制其介導的炎癥反應，減輕炎癥損傷，協(xié)助巨噬細胞減少病原菌。Asami等[27]探討MSCs在急性肺炎鏈球菌肺炎感染小鼠中的抗炎作用，結果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，MSCs注射后肺炎鏈球菌感染模型小鼠TNF-α、IL-6、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和γ干擾素顯著降低，且細菌負荷數(shù)顯著降低；肺泡組織中巨噬細胞表型調節(jié)為M2型。其他相關研究同樣證實MSCs可以通過在肺部損傷部位極化M2型巨噬細胞抑制炎癥進展，促進炎癥修復，保護肺部功能[28-29]。

4.4MSCs調節(jié)皮膚切口愈合過程中巨噬細胞介導的炎癥反應 MSCs可以加速皮膚切口愈合，調節(jié)巨噬細胞介導的炎癥反應。Zhang等[30]首次將從人類牙齦處分離出來的MSCs為移植細胞，治療皮膚切口模型小鼠，并設空白對照組。觀察兩組在相同時間下的切口愈合百分率，并用酶聯(lián)免疫吸附測定切口皮膚組織TNF-α、IL-6和IL-10水平。結果顯示。與對照組比較，MSCs移植治療組小鼠切口愈合率高，皮膚組織致炎性細胞因子TNF-α和IL-6水平顯著降低，抗炎細胞因子IL-10水平顯著增加。結果證實牙齦源性MSCs可能通過抑制炎性細胞浸潤、炎性細胞因子分泌，促進抗炎細胞因子IL-10產(chǎn)生等機制，促進皮膚切口愈合。其他研究者同樣證實了MSCs治療促進皮膚切口愈合機制主要是通過MSCs旁分泌機制，調控切口組織炎癥反應，促進組織的修復[31]。

5 MSCs調節(jié)巨噬細胞免疫表型機制

MSCs對單核/巨噬細胞轉化機制目前并沒有完全被了解，近年來多項研究證實，MSCs影響單核/巨噬細胞主要使通過旁分泌機制，通過分泌IL-10、PGE2、IDO、TGF-β等細胞因子從而使單核/巨噬細胞由M1向M2轉化[32-34]。

血漿中抗炎因子IL-10的變化是MSCs移植后的關鍵，IL-10可以促進組織的炎癥修復，降低炎性損傷，促進單核/巨噬細胞向M2轉化。Holladay等[35]用MSCs與攜帶IL-10質粒功能性支架同時置入心肌梗死模型大鼠心肌梗死部位，結果顯示與對照組比較，治療后心肌梗死組織區(qū)域M1亞型巨噬細胞顯著降低，而M2亞型巨噬細胞顯著增加，心肌組織內MSCs存活數(shù)量增加，心臟重構逆轉和組織炎癥程度減輕，并且顯著改善心肌梗死大鼠心功能。Jung等[36]直接將IL-10注射到心肌梗死模型小鼠體內，治療后7 d與安慰劑對照組比較，治療組心肌梗死后心臟收縮末容積、左心室射血分數(shù)、梗死面積顯著改善，對心肌梗死周圍組織進行免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)治療組分離的組織巨噬細胞CD163、Arg1、TGF-β1等多個M2標記抗體表達顯著升高。同時，其他研究也證實MSCs通過旁分泌機制在體內能促進巨噬細胞分泌IL-10，這可能是MSCs介導單核細胞/巨噬細胞M1/M2亞型轉化的主要機制之一[32-34]。

PGE2是重要的抗炎因子，Yl?stalo等[37]使用PGE2特異性抑制劑(環(huán)加氧酶2抑制劑)后，其巨噬細胞的抗炎作用顯著減弱，抗炎的IL-10、IL-1α表達顯著下降。在MSCs條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)高表達PGE2，采用此培養(yǎng)基促使巨噬細胞M2特異性標記CD206表達升高，增加IL-10的分泌。Hyvarinen等[38]進一步研究MSCs和MSCs外泌體對巨噬細胞的調節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)MSCs和MSC-EV與巨噬細胞共培養(yǎng)，相對于空白對照組可以顯著上調IL-10，下調IL-23、IL-22的表達，并上調了巨噬細胞M2的表型和增強吞噬能力。在MSC-EV共培養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)PGE2顯著上調，證明MSC-EV可能是通過PGE2介導巨噬細胞表型改變，并促進炎癥介質轉換。

MSCs能夠釋放IDO，而IDO可以促進巨噬細胞向M2轉化，并且釋放更多的IL-10[39]。Francois等[39]與Lee等[40]在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，與MSCs共培養(yǎng)后巨噬細胞相比于空白對照IDO的表達上升，炎性因子INF-α下降，M2型巨噬細胞的表達上升，并表現(xiàn)出抗炎的特性；但使用IDO的特異性抑制劑I-MT處理后，INF-α表達上升，其抗炎效應被顯著抑制。這些實驗表明，MSCs可能是通過IDO途徑來調節(jié)巨噬細胞免疫表型來調控炎癥的。

TGF-β1是M2型單核/巨噬細胞的重要標志性因子，TGF-β1可以反映M2型單核/巨噬細胞的轉化率[20，41]，降低炎性損傷，促進組織修復。Liu等[42]在聚糖硫酸鈉、誘導的結腸炎模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，向模型小鼠內注射TGF-β1，其病理切片顯示炎癥得到顯著緩解。注射MSCs后模型小鼠，較空白對照組TGF-β1的表達顯著上升，IL-6、IL-17、INF-γ等多種促炎的細胞因子顯著下降，巨噬細胞被極化成M2型，并且結腸炎癥狀得到顯著緩解。這說明MSCs可能是通過TGF-β途徑調節(jié)巨噬細胞免疫表型發(fā)揮出抗炎作用。

外泌體是含有生物活性分子，它包括蛋白質小膜質囊泡，信使RNA和微RNA，其可以在細胞之間傳送并由此調節(jié)細胞活動和表型[43]。Ti等[41]用脂多糖預處理人臍帶血MSCs，收集上清液通過超速離心分離得到MSCs外泌體，將外泌體加入巨噬細胞培養(yǎng)基中，處理后的巨噬細胞高表達CD163，且抗炎因子(IL-10、TGF-β)分泌增高，其結果證實MCS-EV可以上調M2巨噬細胞表達。通過微RNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)是外泌體let7b大量表達，進而通過蛋白質印跡分析發(fā)現(xiàn)let7b是通過Toll樣受體4/核因子κB/信號轉導及轉錄激活因子3/蛋白激酶B信號通路調節(jié)巨噬細胞極化。Song等[44]觀察在使用IL-1β處理后的MSCs，選擇性將抗炎miR-146a被包入外泌體中轉移至巨噬細胞內，使其轉化為M2型，發(fā)揮抗炎效應。

6 結 語

MSCs在細胞、組織、系統(tǒng)多個水平上發(fā)揮其免疫調節(jié)作用，對單核細胞/巨噬細胞介導炎癥反應是MSCs主要的炎癥調控機制之一。MSCs促進巨噬細胞從M1型轉化成M2型，釋放抑炎的細胞因子，抑制促炎細胞因子的表達，進而減少組織炎性損傷，抑制炎癥的進展，促進炎癥組織修復。MSCs可能是通過IL-10、IDO、PGE2、TGF-β等途徑調節(jié)單核細胞/巨噬細胞的免疫表型，但其分子機制還需進一步研究，其結果將有助于了解干細胞治療機制，并促進干細胞治療在臨床實踐中的應用與推廣。