孫婧宇，李艷紅

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔預(yù)防科，昆明 650106)

齲病是最常見的口腔疾病之一，是一種由口腔內(nèi)多種因素復(fù)合作用于牙齒硬組織而導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性疾病，發(fā)病率高，分布廣泛。世界衛(wèi)生組織已將齲病與癌癥以及心血管疾病并列為人類三大重點(diǎn)防治疾病。數(shù)百萬(wàn)年來(lái)，微生物和人體通過相互適應(yīng)和功能整合構(gòu)建了一個(gè)完整的“超級(jí)有機(jī)體”[1]。這一進(jìn)化過程產(chǎn)生了一個(gè)高度選擇、多樣化的口腔微生物群[2]。大約有700種口腔細(xì)菌已被鑒定出來(lái)，其中50%尚未被培養(yǎng)出，有些僅通過DNA序列發(fā)現(xiàn)?？谇晃⑸锶号c宿主相互作用、相互依賴，在微生態(tài)環(huán)境中共同構(gòu)成微生態(tài)系統(tǒng)[3]。早在1994年Marsh等[4]就提出了“生態(tài)菌斑學(xué)說(shuō)”，即口腔微生態(tài)系統(tǒng)通過能量流動(dòng)、物質(zhì)循環(huán)以及基因傳遞保持口腔微生態(tài)的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。然而，當(dāng)微生態(tài)環(huán)境中關(guān)鍵因素改變，致使某些條件致病菌競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，口腔穩(wěn)態(tài)被打破，原有的低致齲菌群轉(zhuǎn)化為高致齲菌群，導(dǎo)致齲病發(fā)生。微生態(tài)改善治療是指通過促進(jìn)有益菌、抑制致病菌生長(zhǎng)和繁殖使口腔微生態(tài)重新恢復(fù)平衡的治療方法[5]?，F(xiàn)就齲病微生態(tài)的主要研究方法和微生態(tài)改善療法的研究進(jìn)展予以綜述。

1 口腔微生物研究方法

從病因?qū)W來(lái)說(shuō)，齲病是口腔微生態(tài)失衡導(dǎo)致的疾病。因此，齲病的研究必須從口腔微生態(tài)開始。口腔是人體中最復(fù)雜、最活躍、最多樣的微生物聚集地之一，也是公認(rèn)的最古老的微生態(tài)系統(tǒng)?？谇晃⑸锶阂子谌?，是人類研究最多的微生物群，一般可作為微生物學(xué)研究模型。對(duì)口腔微生態(tài)進(jìn)行研究有助于更清晰地闡明口腔微生態(tài)中各細(xì)菌相互作用的機(jī)制，并有助于研究治療和預(yù)防齲病的潛在途徑。口腔微生物研究方法是進(jìn)行口腔微生態(tài)研究的基礎(chǔ)，研究方法的不斷改進(jìn)也為微生態(tài)研究提供了便利和依據(jù)。

細(xì)菌的分離培養(yǎng)一直是口腔微生物研究的基礎(chǔ)。但因口腔是一個(gè)開放的生態(tài)系統(tǒng)，細(xì)菌的數(shù)量和種類受外界環(huán)境影響，且大量細(xì)菌無(wú)法培養(yǎng)，所以到目前為止仍有1/3～1/2的口腔微生物尚未被培養(yǎng)出來(lái)[6]。近年來(lái)，得益于現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展，口腔微生物群的組成和結(jié)構(gòu)逐漸被學(xué)者所了解?？谇晃⑸锶旱难芯糠椒ㄓ泻芏喾N，其中最主要的是傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)法和現(xiàn)代分子生物學(xué)法。

1.1傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)法 傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)法是采集唾液、齦溝液或牙菌斑等樣本后，在實(shí)驗(yàn)室將樣本進(jìn)行稀釋、接種和培養(yǎng)，隨后對(duì)培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、分離純化以及生理生化鑒定。

據(jù)估計(jì)，地球上99%以上的細(xì)菌尚未在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出來(lái)[6]?，F(xiàn)在已經(jīng)分離、培養(yǎng)、鑒定、描述和分類了約350種人類口腔中定植的細(xì)菌，但仍有50%的口腔細(xì)菌無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)[7]?？谇粌?nèi)細(xì)菌的培養(yǎng)需要不同的條件，如培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)溫度、化學(xué)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子等。盡管目前實(shí)驗(yàn)室已盡可能地滿足這些條件，但很多口腔細(xì)菌仍然無(wú)法以常規(guī)的方式培養(yǎng)出來(lái)，可能是因?yàn)樗鼈兣c其他有機(jī)體有特殊的代謝聯(lián)系[8]。除此之外，缺乏某些特殊營(yíng)養(yǎng)素或生長(zhǎng)因子、培養(yǎng)基毒性、細(xì)菌感應(yīng)以及其他信號(hào)系統(tǒng)的破壞或其他未知原因也導(dǎo)致許多菌種無(wú)法在體外進(jìn)行培養(yǎng)?？谇患?xì)菌并不是孤立地生活在生物膜的復(fù)雜群落中，它們之間具有協(xié)同和拮抗作用，相互依賴得以生長(zhǎng)和生存[9]。傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)法在揭示口腔微生物組的多樣性方面具有明顯的局限性，已漸漸無(wú)法滿足口腔微生物群組成和結(jié)構(gòu)研究的需求，但其在微生物的分類及鑒定中仍非常重要。

1.2現(xiàn)代分子生物學(xué)分析方法 現(xiàn)代分子生物學(xué)是一種可以直接對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行分析，通過檢測(cè)和分析從微生物群落中提取的核酸或蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物群落多樣性和功能性的研究。目前常用的現(xiàn)代分子生物學(xué)分析方法主要有熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和高通量測(cè)序技術(shù)。

FISH是一種核酸探針雜交技術(shù)?；驹硎菍в袩晒鈽?biāo)記的探針與特異的互補(bǔ)序列雜交，通過對(duì)激發(fā)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)以鑒定和定量分析特異性微生物[10]。激光掃描共聚焦顯微鏡常與FISH結(jié)合用于研究完整的生物膜，以提高對(duì)微生物群落空間關(guān)系及其變化的分析能力。使用FISH和激光掃描共聚焦顯微鏡可以從剩余牙菌斑生物膜厚度、不同層面菌斑圖像、三維立體結(jié)構(gòu)、死菌和活菌的數(shù)量及百分比、細(xì)菌活性等方面觀察牙菌斑的變化[11]。

高通量測(cè)序技術(shù)即新一代測(cè)序技術(shù)，是測(cè)定DNA分子中核苷酸精確順序的方法，其特點(diǎn)是通量高、耗費(fèi)小，可一次進(jìn)行幾百萬(wàn)條單獨(dú)DNA分子的測(cè)序，且無(wú)需提前克隆及圖譜制作。新一代高通量測(cè)序技術(shù)為認(rèn)識(shí)微生物群落的結(jié)構(gòu)及功能、組成及豐度等的差異等起到了重要作用[5]。李瑩和儀虹[12]采集10例無(wú)齲和10例高齲受試者的唾液樣本，提取樣本細(xì)菌總基因組DNA，然后進(jìn)行16 Sr DNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和454焦磷酸測(cè)序,結(jié)果顯示，不同個(gè)體之間唾液菌群結(jié)構(gòu)差異較大，高齲組較無(wú)齲組有更高的微生物多樣性，但兩組擁有共同的核心微生物。該研究認(rèn)為，齲病不是由某些特定致病微生物造成的，而是口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性及其變化導(dǎo)致的。

2 齲病的微生態(tài)改善療法

生態(tài)菌斑假說(shuō)是為解釋齲病的病因而提出的，其總結(jié)了口腔微生態(tài)環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，很多口腔疾病是由口腔微生態(tài)失調(diào)引起的，并且口腔疾病也會(huì)引起微生物環(huán)境的改變[4]。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到采用合適的方法調(diào)整口腔菌群平衡是預(yù)防和治療各種口腔疾病的關(guān)鍵，同時(shí)提出了微生態(tài)改善治療。微生態(tài)改善治療的目標(biāo)是恢復(fù)微生態(tài)的平衡，目前主要用于胃腸道疾病的治療和預(yù)防。微生態(tài)改善治療從針對(duì)特定物種到替換整個(gè)微生物區(qū)系都有涉及。目前針對(duì)口腔微生態(tài)的改善療法主要有免疫策略、益生菌療法以及中藥防齲。

2.1免疫策略 早在19世紀(jì)60年代，國(guó)外學(xué)者就開始了防齲疫苗的研究，期望通過接種某種防齲疫苗以阻止致齲菌在口腔中的黏附和定植，達(dá)到調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡、預(yù)防齲病的目的[13]。齲病的免疫學(xué)預(yù)防主要分為主動(dòng)免疫防齲和被動(dòng)免疫防齲。主動(dòng)免疫是將抗原性物質(zhì)人工接種到機(jī)體上，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，以提高機(jī)體的抗病能力。主動(dòng)免疫防齲方法主要有全菌細(xì)胞抗原免疫、重組細(xì)菌抗原免疫、抗原分子免疫等。被動(dòng)免疫是指給機(jī)體輸注外源性免疫效應(yīng)物質(zhì)、致敏淋巴細(xì)胞后獲得的特異性免疫能力。被動(dòng)免疫防齲方法主要有轉(zhuǎn)基因植物免疫、多克隆抗體、單克隆抗體防齲等。

1993年，Parkash等[14]對(duì)171例兒童的患齲情況與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答情況進(jìn)行了研究。收集研究對(duì)象的淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用變異鏈球菌作為抗原刺激物觀察淋巴細(xì)胞的變形程度，得出刺激指數(shù)。結(jié)果顯示，與高齲兒童相比，低齲兒童刺激指數(shù)較高；在齲病的不同階段，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)保護(hù)作用。Simón-Soro等[15]利用熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記特異性抗體發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白A是影響齲病危險(xiǎn)性的重要因素，患齲唾液與無(wú)齲唾液中免疫球蛋白A的比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。唾液抗體和其他保護(hù)性成分對(duì)牙釉質(zhì)的免疫應(yīng)答發(fā)揮重要保護(hù)作用。

在預(yù)防齲病方面，被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫均取得了較好的效果，但這些方法僅是以變異鏈球菌的表面抗原為基礎(chǔ)[16]。研究證實(shí)，齲洞內(nèi)的微生物群落具有高度多樣性，變異鏈球菌在整個(gè)齲洞微生物群落中所占的比例不到1%[17]。此外，與齲病有關(guān)的微生物群落存在較大的個(gè)體差異，即使是同一個(gè)體不同齲損區(qū)的細(xì)菌活躍性也有較大差異[18]。因此，單一物種或單個(gè)表面抗原用于主動(dòng)和被動(dòng)免疫具有一定的局限性[19]。此外，全菌細(xì)胞抗變異鏈球菌抗體可與機(jī)體某些組織蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，從而產(chǎn)生免疫復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，如細(xì)菌性心內(nèi)膜炎。變異鏈球菌與其他口腔鏈球菌有交叉反應(yīng)性抗原,所以防齲疫苗介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能會(huì)破壞口腔正常菌群的生態(tài)平衡[20]。

2.2益生菌療法 益生菌是一種當(dāng)給予足夠劑量時(shí)有益于宿主健康的活的微生物[21]。益生菌療法是指用益生菌替代病原微生物，以恢復(fù)微生態(tài)平衡的方法[22]，目前多用于防治消化系統(tǒng)的菌群失調(diào)?？谇皇窍到y(tǒng)的起始端，齲病是一種口腔菌群失調(diào)導(dǎo)致的疾病。有學(xué)者提出，將益生菌療法運(yùn)用于口腔可達(dá)到預(yù)防齲病的目的[23]。乳桿菌和雙歧桿菌是最主要的兩種益生菌，對(duì)鏈球菌和念珠菌的生長(zhǎng)有抑制作用[24]，作用機(jī)制包括改變口腔內(nèi)pH，產(chǎn)生抗菌化合物對(duì)抗病原體，競(jìng)爭(zhēng)病原體結(jié)合和受體位點(diǎn)，刺激免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)等。Aminabadi等[25]給予105名兒童含有鼠李糖乳桿菌GG株的酸奶后，口腔致齲菌的數(shù)量明顯下降。Jindal等[26]的研究證明，食用益生菌片劑可使變異鏈球菌的數(shù)目顯著下降。但也有學(xué)者認(rèn)為，益生菌對(duì)致齲菌無(wú)抑制作用，有些益生菌甚至?xí)铀冽x病進(jìn)程[27]。一項(xiàng)隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌F19對(duì)變異鏈球菌等致齲菌無(wú)抑制作用，且干酪乳桿菌F19也未在口腔中定植[28]。Cildir等[29]發(fā)現(xiàn)，兒童服用羅伊乳桿菌后致齲菌變異鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量并未減少。Schwendicke等[30]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌不但不能抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng),反而誘導(dǎo)牙本質(zhì)脫礦加速，導(dǎo)致齲病加重。

近年來(lái)一些口腔新物種被分離出來(lái)，包括鏈球菌A12[31]和S.dalsani[32]，其兼具抗菌和抗酸的功能。這些口腔微生物較傳統(tǒng)乳制品或腸道相關(guān)益生菌更佳，雖然在口腔中的定植能力有限，但能發(fā)揮更多潛在的有益功能。因此，接種這些潛在的有益的口腔微生物或通過使用刺激其生長(zhǎng)和有益功能的益生元以調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)以研究其在人體口腔中的定植能力和改善口腔健康方面的效果。

除上述益生菌外，益生元對(duì)調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡也有一定的作用。精氨酸是一種合適的益生元。臨床研究表明，在牙膏中添加適量精氨酸可顯著改善有低度到中度齲病風(fēng)險(xiǎn)人群的患齲情況[33]。在體外實(shí)驗(yàn)中，精氨酸對(duì)口腔微生態(tài)的調(diào)節(jié)具有積極作用[34]。目前關(guān)于其他益生元對(duì)口腔健康的潛在作用的研究依然非常有限。

2.3中藥防齲 使用中藥預(yù)防齲病是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。中藥預(yù)防齲病的機(jī)制主要有兩方面：①對(duì)牙體組織再礦化的作用；②抑制致齲菌黏附，影響牙菌斑生物膜的結(jié)構(gòu)。

動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，五倍子可有效抑制變異鏈球菌在細(xì)菌生物膜中的生長(zhǎng)，抑制菌斑中致齲微生物的活性[35]。厚樸酚可以抑制變異鏈球菌的黏附、生長(zhǎng)以及產(chǎn)酸，還可影響細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)和致齲菌的活性[36]。茶葉中具有防齲作用的成分是茶多酚。茶多酚可抑制致齲菌生長(zhǎng)，減少變異鏈球菌附著，降低變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，可有效調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡[37]。除此之外，白芨、黃苓、丁香、大黃、虎杖、檸檬、蜂膠等均具有不同程度的抑制致齲菌黏附、生長(zhǎng)、產(chǎn)酸的作用[38]。但以上研究多在體外進(jìn)行，在體內(nèi)，尤其是在復(fù)雜的口腔微生態(tài)環(huán)境中，中藥是否還可以發(fā)揮調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡的作用尚無(wú)結(jié)論。

3 小 結(jié)

近年來(lái)，使用現(xiàn)代分子生物學(xué)分析技術(shù)和顯微鏡技術(shù)的口腔微生態(tài)研究受研究成本和檢測(cè)方法的限制，通常樣本數(shù)量較少，導(dǎo)致這些研究有很大的局限性。隨著研究方法的不斷改進(jìn)，口腔微生態(tài)的多組學(xué)研究也得到長(zhǎng)足的發(fā)展。目前大部分的口腔微生物研究都集中在細(xì)菌多樣性上，忽視了口腔中真菌和病毒對(duì)口腔微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用[39]。未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)病毒和真菌在口腔中作用的研究。

在臨床實(shí)踐中，齲病的治療通常被理解為以恢復(fù)牙齒結(jié)構(gòu)、功能和美學(xué)要求為基礎(chǔ)的牙體硬組織的修復(fù)。但這并不是對(duì)齲病本身的治療，而是對(duì)其后果的治療。此外，口腔微生物群具有個(gè)體差異性，患齲由遺傳和口腔微生態(tài)環(huán)境共同決定[40]。防齲的目標(biāo)是采取相應(yīng)的預(yù)防或治療措施調(diào)控影響齲病發(fā)生的多種因素，恢復(fù)口腔微生物穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而控制齲病進(jìn)展，恢復(fù)牙齒的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，無(wú)論是免疫策略、益生菌療法還是中藥防齲都可以在一定程度上阻礙致齲菌的黏附、定植和生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡，達(dá)到有效防齲的目的[41]。盡管防齲研究已取得了一些成果，但這些種方法均存在一定的缺陷，甚至有研究認(rèn)為這些方法并不能達(dá)到防齲的目的，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致口腔微生態(tài)紊亂[6]。因此，尚需深入研究各種調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡的防齲方法的作用機(jī)制，并進(jìn)行長(zhǎng)期、大樣本的臨床試驗(yàn)以觀察防齲方法的效果。