高俊丁興紅丁志山范永升

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院

阿司匹林（aspirin）是常用的解熱鎮(zhèn)痛消炎藥[1]，主要通過(guò)抑制環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）發(fā)揮作用，長(zhǎng)期使用阿司匹林會(huì)引起胃腸道不良反應(yīng)[2]，嚴(yán)重者引起胃潰瘍及胃出血[3]。目前，針對(duì)阿司匹林引起的胃潰瘍，臨床上主要是以?shī)W美拉唑等抗?jié)兯幬镏委?，但是這些藥物可能引起低鎂血癥[4]、皮膚損害[5]以及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的不良反應(yīng)；此外，臨床上使用選擇性COX-2抑制劑來(lái)代替阿司匹林，但是選擇性COX-2抑制劑仍然可能導(dǎo)致消化道損傷[6]，還可能造成血栓形成[7]、腎毒性[8-9]、肝臟不良反應(yīng)[10]等。研究能夠減輕阿司匹林所致的胃損傷且不良作用少的藥物具有重要意義。

白及為蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]的干燥塊莖，味苦、甘、澀，性微寒，歸肺、胃、肝經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌的功效[11]。研究發(fā)現(xiàn)白及可促進(jìn)胃上皮細(xì)胞更新，增強(qiáng)防御功能[12]，但對(duì)其具體影響指標(biāo)未做深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察白及對(duì)阿司匹林誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的影響，進(jìn)一步探討白及的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002]。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品、試劑及儀器 白及飲片購(gòu)于浙江天道醫(yī)藥有限公司（批號(hào)：170901）；阿司匹林購(gòu)于拜耳醫(yī)藥保健有限公司（100mg/片，批號(hào)：J20130078）；奧美拉唑購(gòu)于康恩貝生物制藥有限公司（20mg/粒，批號(hào)：H19991118）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于達(dá)科為生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：DKW12-3720-048、12-3060-096）；胃黏膜前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司（批號(hào)：MB-1609A、MB-6634A）；鼠抗 COX-1單克隆抗體、羊抗COX-2多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗、驢抗山羊IgG二抗均購(gòu)于 Abcam 公司（批號(hào)：ab695、ab23672、ab8226、ab205719、ab205723）；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒為寶生物工程有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：RR036A、RR820A）。Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)于Thermo公司；iCycler iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物建模及分組 48只雄性Wistar大鼠按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法分為正常組、模型組、白及高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。根據(jù)湯宏斌等[13]所著的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》中成人與大鼠劑量換算，得出大鼠用白及劑量為315mg·kg-1，設(shè)為中劑量，取其2倍為高劑量，0.5倍為低劑量。除正常組予0.9%氯化鈉溶液灌胃外，余各組予阿司匹林200mg·kg-1灌胃造模，共8周。8周后，陽(yáng)性對(duì)照組予奧美拉唑15mg·kg-1灌胃，白及高、中、低劑量組分別予 630、315、157.5mg·kg-1白及混懸液灌胃，正常組和模型組繼續(xù)予0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃體積均為 10mL·kg-1，1 次/d，共 4 周。4 周后取大鼠眼眶血和胃組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血清炎性指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠末次灌胃后第2天眼眶取血，4 000r/min離心20min分離血清，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6的表達(dá)，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 胃黏膜PGE2、ET表達(dá)水平檢測(cè) 處死大鼠并將胃摘除，分離胃組織，將胃組織在冰面上展平，用蓋玻片刮取胃黏膜，迅速放入液氮冷凍。取50mg胃黏膜加入9倍體積的0.9%氯化鈉溶液制備組織勻漿，4℃下2 500r/min離心10min。分離上清液，ELISA法檢測(cè)PGE2、ET的表達(dá)，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 胃黏膜COX-1、COX-2蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè) 取冷凍的胃黏膜50mg，放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入0.5mL細(xì)胞裂解液，冰上研磨。組織勻漿4℃下12 000r/min離心20min，收集上清液，-80℃無(wú)菌保存。按BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。各組取等量蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉搖床封閉2h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10min共3次，二抗孵育2h，TBST洗膜10min共3次，凝膠成像系統(tǒng)拍照后以Image J軟件測(cè)定目的條帶灰度值，與內(nèi)參β-actin灰度值比較，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè) 取冷凍的胃黏膜組織100mg，用Trizol提取總RNA，按試劑盒方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為 95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)，50℃ 30s。采用β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各組中目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列見(jiàn)表1。

1.4.5 胃組織病理學(xué)觀察 胃組織平鋪于臺(tái)上，大體觀察病理改變，按Guth等[14]研究的方法計(jì)算潰瘍指數(shù)；取胃組織，多聚甲醛固定24h，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟等過(guò)程制成蠟塊，切片后HE染色，100倍鏡下觀察。

表1 引物序列Tab.1 Primer squences

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6表達(dá)比較 與正常組比較，模型組與各藥物組大鼠血清TNF-α、IL-6表達(dá)均增加（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清 TNF-α、IL-6表達(dá)降低（P＜0.01），白及高、中、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6表達(dá)均降低（P＜0.01，P＜0.05）。與白及低劑量組比較，白及高、中劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6表達(dá)均降低（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

2.2 各組大鼠胃黏膜PGE2、ET表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠和白及各劑量組大鼠胃黏膜組織PGE2表達(dá)減少（P＜0.01，P＜0.05），ET 表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組 PGE2表達(dá)減少（P＜0.05），ET表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃黏膜組織PGE2表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ET表達(dá)減少（P＜0.05），白及高、中、低劑量組大鼠胃黏膜組織PGE2表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05），ET 表達(dá)減少（P＜0.01，P＜0.05）。與白及低劑量組比較，白及高、中劑量組大鼠胃黏膜組織 PGE2表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05），ET 表達(dá)減少（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表 2 各組大鼠血清 TNF-α、IL-6 表達(dá)比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of expression of TNF-α and IL-6 in serum of each group(±s，pg·mL-1)

表 2 各組大鼠血清 TNF-α、IL-6 表達(dá)比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of expression of TNF-α and IL-6 in serum of each group(±s，pg·mL-1)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白及低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01;compared with Bletilla striata low dose group,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

組別 n TNF-α IL-6正常組模型組白及高劑量組白及中劑量組白及低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組8 8 8 8 8 8 211.73±11.42 299.28±16.81**238.73±15.62**##△△265.45±14.28*#△272.63±9.33*#248.35±14.49**##101.28±10.25 152.32±12.72**140.56±11.94*#△△147.71±13.99*#△151.54±10.61*#128.83±12.39*##

2.3 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2蛋白表達(dá)比較

表3 各組大鼠胃黏膜PGE2、ET表達(dá)比較（±s）Tab.3 Comparison of expression of PGE2and ET in gastric mucosa of each group(±s)

表3 各組大鼠胃黏膜PGE2、ET表達(dá)比較（±s）Tab.3 Comparison of expression of PGE2and ET in gastric mucosa of each group(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白及低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01;compared with Bletilla striata low dose group,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

組別nPGE2（ng·L-1）ET（μg·L-1）正常組模型組白及高劑量組白及中劑量組白及低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組8 8 8 8 8 8 476.95±10.74 244.98±20.53**373.42±21.96*##△△307.63±17.55*##△285.41±19.63*#286.19±25.77*73.36±9.21 101.59±10.48**82.66±5.99**##△89.86±12.37*##△95.15±11.65*#90.47±9.14*#

與正常組比較，模型組與各藥物組大鼠胃黏膜組織COX-1蛋白表達(dá)減少（P＜0.01，P＜0.05）、COX-2蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃黏膜組織COX-1蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）、COX-2蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），白及高、中、低劑量組大鼠胃黏膜組織 COX-1 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05）、COX-2蛋白表達(dá)減少（P＜0.01，P＜0.05）。與白及低劑量組比較，白及高、中劑量組大鼠胃黏膜組織COX-1蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）、COX-2蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖1及表4。

圖1 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparison of expression of COX-1 and COX-2 protein in gastric mucosa of each group

表4 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of expression of COX-1 and COX-2 protein in gastric mucosa of each group(±s)

表4 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of expression of COX-1 and COX-2 protein in gastric mucosa of each group(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白及低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01;compared with Bletilla striata low dose group,ΔP＜0.05

組別 n COX-1/β-actin COX-2/β-actin正常組模型組白及高劑量組白及中劑量組白及低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組8 8 8 8 8 8 0.98±0.11 0.42±0.15**0.85±0.09*##△0.61±0.05*##△0.55±0.14*#0.84±0.06*##0.12±0.06 0.42±0.08*0.31±0.10*##△0.34±0.05*#△0.40±0.08*#0.37±0.04*#

2.4 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2基因表達(dá)比較與正常組比較，模型組與各藥物組大鼠胃黏膜組織COX-1基因表達(dá)減少（P＜0.01，P＜0.05）、COX-2 基因表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃黏膜組織COX-1基因表達(dá)增加（P＜0.01）、COX-2基因表達(dá)減少（P＜0.05），白及高、中、低劑量組大鼠胃黏膜組織 COX-1基因表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05）、COX-2基因表達(dá)減少（P＜0.01，P＜0.05）。與白及低劑量組比較，白及高、中劑量組大鼠胃黏膜組織COX-1基因表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05），COX-2 基因表達(dá)減低（P＜0.01）。見(jiàn)表 5。

2.5 各組大鼠胃黏膜病理學(xué)觀察

2.5.1 各組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)比較 與正常組比較，模型組與各藥物組大鼠潰瘍指數(shù)增加（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠潰瘍指數(shù)降低（P＜0.01），白及高、中、低劑量組大鼠潰瘍指數(shù)降低（P＜0.01，P＜0.05）；與白及低劑量組比較，白及高、中劑量組大鼠潰瘍指數(shù)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表5 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2基因表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of expression of COX-1 and COX-2 gene in gastric mucosa of each group(±s)

表5 各組大鼠胃黏膜COX-1、COX-2基因表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of expression of COX-1 and COX-2 gene in gastric mucosa of each group(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白及低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01;compared with Bletilla striata low dose group,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 n COX-1/β-actin COX-2/β-actin正常組模型組白及高劑量組白及中劑量組白及低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組8 8 8 8 8 8 0.65±0.09 0.38±0.05**0.51±0.06**##△△0.46±0.10**#△0.40±0.08*#0.50±0.11*##0.04±0.02 0.26±0.07**0.21±0.10*##△△0.23±0.09*#△△0.25±0.11*#0.25±0.03*#

表6 各組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)比較（±s）Tab.6 Comparison of ulcer index in gastric mucosa of each group(±s)

表6 各組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)比較（±s）Tab.6 Comparison of ulcer index in gastric mucosa of each group(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白及低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01;compared with Bletilla striata low dose group,△P＜0.05

組別n 潰瘍指數(shù)正常組模型組白及高劑量組白及中劑量組白及低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組8 8 8 8 8 8 0.00±0.00 19.75±3.96**10.47±3.73*##△13.55±8.61*##△19.21±7.45**#8.38±2.20*##

2.5.2 各組大鼠胃組織病理改變比較 正常組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞呈單層柱狀排列整齊，基本未見(jiàn)缺損、脫落，固有層未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體形狀規(guī)整；模型組大鼠胃黏膜變薄，病灶處上皮細(xì)胞脫落，出現(xiàn)缺損，黏膜固有腺體數(shù)量明顯減少，排列稀疏紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層出血，黏膜下層水腫；白及高、中劑量組大鼠胃黏膜變薄，上皮結(jié)構(gòu)修復(fù)，少量缺損、脫落，黏膜固有腺體增生較多，排列較整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；白及低劑量組大鼠胃黏膜變薄，病灶處上皮細(xì)胞脫落，出現(xiàn)缺損，黏膜固有腺體少量增生，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層出血；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，上皮結(jié)構(gòu)修復(fù)，黏膜固有腺體增生數(shù)量較多，排列整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層水腫。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠胃體病理改變（HE染色，100×）Fig.2 Pathological changes of gastric body in each group(HE stained,100×)

3 討論

阿司匹林進(jìn)入機(jī)體后同時(shí)抑制COX-1和COX-2的表達(dá)，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的藥效[15-16]；但是其對(duì)于COX-1和COX-2的非選擇性抑制使得PGE2生成減少、ET生成增加。PGE2生成減少，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用被削弱；ET則是體內(nèi)強(qiáng)烈收縮血管的物質(zhì)[17]，其表達(dá)增加使胃黏膜微血管收縮加劇，黏膜血供減少，兩方面因素共同致使胃潰瘍形成。TNF-α和IL-6作為重要的炎性細(xì)胞因子，參與胃黏膜的受損過(guò)程[18]，是指示潰瘍形成的較直觀指標(biāo)。有研究指出阿司匹林能夠誘導(dǎo)TNF-α和白細(xì)胞介素分泌增加，促使胃潰瘍發(fā)生[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予大鼠灌胃阿司匹林，成功構(gòu)建胃潰瘍模型。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平增高，胃黏膜組織COX-1表達(dá)減少，COX-2的表達(dá)增加，PGE2生成減少、ET生成增加。阿司匹林造模后大鼠胃黏膜COX-2的表達(dá)增加，探究其原因，有文獻(xiàn)報(bào)道COX-2的啟動(dòng)子區(qū)域含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB 調(diào)控的靶基因包括 COX-2[19]；TNF-α作為重要促炎因子，能通過(guò)與其受體的結(jié)合激活NF-κB信號(hào)通路[20]。筆者推斷，阿司匹林誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)增加，可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)了胃黏膜COX-2表達(dá)的上升，這可能是阿司匹林造成胃潰瘍后胃黏膜組織COX-2表達(dá)增加的機(jī)制之一，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

白及具有良好的止血作用，是治療胃潰瘍的常用藥[21]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載白及“主癰腫、惡瘡、敗疽，傷陰死肌，胃中邪氣、賊風(fēng)鬼?yè)?，痱緩不收”[22]?，F(xiàn)代臨床上多用白及粉治療胃潰瘍，效果明顯[23]。本研究對(duì)阿司匹林誘導(dǎo)的胃潰瘍大鼠分別給予西藥奧美拉唑及中藥白及治療，結(jié)果顯示，奧美拉唑及高劑量白及均有良好的治療胃潰瘍作用。奧美拉唑?yàn)橘|(zhì)子泵抑制劑，本研究數(shù)據(jù)顯示其對(duì)于COX-1、COX-2也具有調(diào)節(jié)作用，具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道，奧美拉唑是否也通過(guò)調(diào)節(jié)COX發(fā)揮抗?jié)冏饔?，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究提示中藥白及能夠顯著減少血清中的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6表達(dá)，調(diào)節(jié)大鼠胃黏膜COX-1、COX-2表達(dá)水平，促使PGE2生成增加、ET生成減少，從而治療胃潰瘍。以上研究結(jié)果表明白及適用于阿司匹林誘導(dǎo)的胃潰瘍的治療，為臨床上用藥的選擇提供了參考。