林 康，田莉莉，常塔娜，溫建新，范偉興

牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)所引起的一種慢性消耗性的傳染病，可經(jīng)呼吸道、消化道進(jìn)行傳播，具體病理表現(xiàn)為組織器官形成明顯的結(jié)核結(jié)節(jié)，繼而結(jié)節(jié)中心出現(xiàn)干酪樣壞死或鈣化。牛結(jié)核病以肺結(jié)核多見(jiàn)，近年來(lái)，也有對(duì)肺外結(jié)核的研究報(bào)道[1]。由于結(jié)核病在世界各地均有發(fā)生，是較為嚴(yán)重的人獸共患病。除了會(huì)影響人畜的健康外，還能夠引起產(chǎn)量下降和貿(mào)易限制從而產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)影響[2]，OIE將其列入法定報(bào)告疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。

牛結(jié)核病檢測(cè)的方法有很多，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、比較變態(tài)反應(yīng)、牛型PPD點(diǎn)眼試驗(yàn)、IFN-γ試驗(yàn)、ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)、病原的分離培養(yǎng)及PCR等方法[3]。目前官方公布的牛結(jié)核病的清除方法主要是基于檢疫和屠宰政策[4]，采用基于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的診斷試驗(yàn)，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和INF-γ試驗(yàn)[5]。我國(guó)以結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)及IFN-γ試驗(yàn)作為牛結(jié)核病檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)因結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，耗費(fèi)時(shí)間，不能滿足臨床診斷的需要。而以PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)在檢測(cè)牛結(jié)核病時(shí)，由于其靈敏度高、特異性低，容易因?yàn)榉侵虏⌒缘姆种U菌如禽分枝桿菌及環(huán)境中的其他分枝桿菌造成假陽(yáng)性的現(xiàn)象，影響判定結(jié)果。依靠單一診斷方法鎖定的陽(yáng)性牛在剖檢時(shí)常常找不到病變部位，為后續(xù)的采樣分菌工作帶來(lái)困難。因此，在牛結(jié)核病的診斷過(guò)程中多種檢測(cè)方法的組合使用有助于牛結(jié)核病的確診。

本試驗(yàn)選擇新疆牛結(jié)核病歷史高發(fā)，且在以往的診斷過(guò)程中存在禽分枝桿菌干擾的某牛場(chǎng)，為鎖定陽(yáng)性牛，找到病變進(jìn)行分菌，綜合運(yùn)用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、牛型PPD 點(diǎn)眼試驗(yàn)、IFN-γ試驗(yàn)、ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)4種免疫學(xué)方法進(jìn)行了牛結(jié)核病的診斷。鎖定陽(yáng)性牛后，對(duì)其撲殺、剖檢，采集病料后進(jìn)行病原的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1材料 牛型 PPD、禽型 PPD、BOVIGAM牛分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒、IDEXX牛分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒、羅氏培養(yǎng)基。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和判斷。

1.2.2牛型PPD點(diǎn)眼反應(yīng) 進(jìn)行點(diǎn)眼前，認(rèn)真檢查待檢奶牛的雙眼，眼觀不正常的不進(jìn)行點(diǎn)眼檢測(cè)。將2～3滴牛型PPD滴入左眼。點(diǎn)眼后，分別在3 h、6 h、9 h各觀察1次反應(yīng)情況，必要時(shí)可在24 h后觀察點(diǎn)眼反應(yīng)。若觀察到黃白色膿性分泌物，判定為陽(yáng)性牛。

1.2.3IFN-γ試驗(yàn) 采集5 mL檢測(cè)牛的抗凝全血，分別用特殊制備的牛型 PPD、禽型 PPD及PBS 3種刺激抗原對(duì)全血進(jìn)行24 h的體外刺激。24 h后，收集刺激上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IFN-γ檢測(cè)。若牛型 PPD 的 OD 值-陰性抗原(PBS)的 OD 值≥0.1 且牛型 PPD 的 OD 值-禽型 PPD 的OD值≥0.1，判定為陽(yáng)性牛。

1.2.4ELISA抗體檢測(cè) 采集檢測(cè)牛的全血，靜置離心后收集血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。其中S/P=(樣品OD值-陰性O(shè)D平均值)/(陽(yáng)性 OD 平均值-陰性 OD 平均值)，若S/P≥0.3，判定為陽(yáng)性牛。

1.3剖檢與病料采集 將4種方法均判定為陽(yáng)性的牛進(jìn)剖檢，檢查病變組織，無(wú)菌采集病變組織置于樣品杯中。

1.4病原分離培養(yǎng) 分離培養(yǎng)前在生物安全柜中將待處理組織進(jìn)行解凍，去除多余脂肪后，切碎組織，制成勻漿液。用巴氏吸管吸取適量的接種液，均勻接種在整個(gè)培養(yǎng)基斜面上。將培養(yǎng)基置于37 ℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種后每過(guò)一周觀察菌落生長(zhǎng)情況，8周后未生長(zhǎng)的為陰性。

1.5PCR鑒定 提取核酸，用已建立的PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行結(jié)核桿菌群內(nèi)的鑒定。

1.5.1引物的合成 根據(jù)文獻(xiàn)[6]中的報(bào)道，由生工合成7對(duì)引物，如表1所示。

表1 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)PCR引物
Tab.1 PCR primers of MTC

PrimersPrimers sequences(5′-3′)Products length/bp16sRNAF:ACGGTGGGTACTAGGTGTGGG-TTTC543R:TCTGCGATTACTAGCGACTCC-GACTTCARv0577F:ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAG-GCAA786R:CTATTGCTGCGGTGCGGGCTT-CAAIS1561F:GCTGGGTGGGCCCTGGAATAC-GT-GAACTC943R:AACTGCTCACCCTGGCCACCA-CCATTGACTRv1510F:GTGCGCTCCACCCAAATAGTTGC1033R:TGTCGACCTGGGGCACAAATC-AGTCRv1970F:GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC1116R:CGCCGGCAGCCTCACGAAATGRv3877/8F:CGACGGGTCTGACGGCCAAAC-TCATC999R:CTTGCTCGGTGGCCGGTTTTT-CAGCRv3120F:GTCGGCGATAGACCATGAGTC-CGTCTCCAT404R:GCGAAAAGTGGGCGGATGCCA-GAATAGT

1.5.2反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序 反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物各1 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 7 μL，反應(yīng)的總體積為20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 1 min變性，64 ℃ 1 min退火，72 ℃ 1 min延伸，循環(huán)30 次；72 ℃ 10 min延伸。結(jié)束后置于4 ℃保存。

1.5.3結(jié)果判定 取5 μL 的PCR產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，條帶根據(jù)文獻(xiàn)[6]按照表2進(jìn)行結(jié)果判斷。

表2 結(jié)核分枝桿菌群內(nèi)PCR方法的判定標(biāo)準(zhǔn)
Tab.2 Criteria for PCR in mycobacterium tuberculosis

Organism16sRNARv0577IS1561Rv1510Rv1970Rv3877/8Rv3120M. tuberculosis+++++++M. africanum subtype I++++-++M. africanum subtype II +++++++“M. canettii”++++++-M. caprae++++-+-M. bovis +++--+-M. bovis BCG+++----M. microti++-+-++MOTT +------

Note：+shows that it can amplifie the target fragmentit;-shows that it cannot.

2 結(jié) 果

2.14種方法綜合檢測(cè)結(jié)果 該牛場(chǎng)為結(jié)核病隔離場(chǎng)，755頭牛均為皮試陽(yáng)性，將點(diǎn)眼、INF-γ試驗(yàn)和ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的牛判定為陽(yáng)性病變牛，共26頭，如表3所示。

表3 4種檢測(cè)方法結(jié)果
Tab.3 Results of the four detection methods

Detection4 detection methodsSICTEye-drops reactionINF-γ test ELISA detectionPositivesAutopsy755755(100%)44(5.8%)352(46.6%)211(27.9%)26(3.4%)5

2.2病原分離鑒定結(jié)果 從26頭陽(yáng)性牛中根據(jù)年齡，泌乳狀況等實(shí)際生產(chǎn)狀況從中隨機(jī)選擇5頭牛進(jìn)行剖檢。剖檢的5頭牛進(jìn)行編號(hào)，分別為03、08、47、94、97，剖檢后均在肺部發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)病變，病變情況見(jiàn)表4。5頭牛的病料培養(yǎng)結(jié)果均為陽(yáng)性。對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)行PCR鑒定，從左至右依次對(duì)應(yīng)的引物16sRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120。根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果均為牛分枝桿菌(圖1)。

M：100 bp DNA maker；1-7，8-14：Isolated strain(All others identical)圖1 MTC群內(nèi)PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR results of MTC

表4 病變結(jié)果
Tab.4 Results of lesions

No.Diseased regionLesion status03lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material08lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material47lungLesion,with nodules94lungLesion,with nodules97lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material

3 討 論

近年來(lái)，我國(guó)在牛結(jié)核病檢疫中以皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)及IFN-γ試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)判定的結(jié)核陽(yáng)性牛剖檢普遍出現(xiàn)在肺臟無(wú)法找到結(jié)核病變的情況，這可能因?yàn)槠渌侵虏⌒缘姆种U菌如禽分枝桿菌及環(huán)境中的其他分枝桿菌造成假陽(yáng)性的結(jié)果[7]，也可能是因?yàn)樯鲜鰞煞N方法均為牛結(jié)核病早期診斷方法，被撲殺的大部分牛仍處于感染早期尚未產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)病變的階段[8]。所以本試驗(yàn)使用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、牛型PPD 點(diǎn)眼試驗(yàn)、IFN-γ試驗(yàn)，ELISA抗體檢測(cè)4種免疫學(xué)診斷方法的組合，對(duì)新疆某奶牛場(chǎng)進(jìn)行了牛結(jié)核病診斷，找到陽(yáng)性病變牛。其中皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ試驗(yàn)是針對(duì)牛結(jié)核早期感染，而PPD點(diǎn)眼和ELISA抗體試驗(yàn)是針對(duì)牛結(jié)核后期感染。在IFN-γ試驗(yàn)中，755頭奶牛中有46.6%的陽(yáng)性率，ELISA抗體檢測(cè)中有27.9%的陽(yáng)性率，4種方法診斷結(jié)果均為陽(yáng)性的牛共26頭。因條件局限，從中隨機(jī)選擇5頭牛進(jìn)行剖檢，均能夠發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)核病變。以此推測(cè)，其余21頭牛剖檢后能夠發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的結(jié)核病變。剖檢結(jié)果證明，多種診斷方法的組合使用能提高牛結(jié)核病的診斷的準(zhǔn)確性，檢出有病變的牛。

從26頭牛中剖檢的5頭牛主要表現(xiàn)為肺結(jié)核，在肺部均有明顯結(jié)節(jié)病變。其中47，94兩頭牛有結(jié)節(jié)病變，其余03，08，97三頭牛切開(kāi)結(jié)節(jié)病變后有大量的干酪樣物質(zhì)，已處于結(jié)核后期感染階段。每頭牛挑選具有典型病變的病料進(jìn)行分菌，4周后觀察培養(yǎng)基表面出現(xiàn)黃色或白色的菌落。5份病料均分離到細(xì)菌，分菌率為100%(5/5)。

將5株菌用多重PCR的方法進(jìn)行分型鑒定，擴(kuò)增片段大小依次為 543 bp、786 bp、943 bp、999 bp，依據(jù)條帶大小和判斷標(biāo)準(zhǔn)，5株菌都為牛分枝桿菌。在4種方法組合的基礎(chǔ)上進(jìn)一步確定鎖定的陽(yáng)性牛為牛分枝桿菌感染。在分離到菌后，可用于牛分枝桿菌的鑒定，將其與臨床上其他重要的非致病性結(jié)核分枝桿菌分開(kāi)來(lái)。

臨床診斷時(shí)，上述4種診斷方法耗時(shí)較長(zhǎng)。如比較變態(tài)反應(yīng)需3 d后觀察結(jié)果，IFN-γ試驗(yàn)需要24 h的孵育時(shí)間，在臨床診斷中急需建立一種操作簡(jiǎn)便，快速高效的診斷方法。已有研究證明牛分枝桿菌存在于感染動(dòng)物的糞便及污染牛場(chǎng)的土壤和飲水中[9]，相較于普通PCR需要分離出病原菌，建立一種能快速有效的檢測(cè)奶樣，糞便或環(huán)境樣品的熒光定量PCR方法可以大幅度的節(jié)約時(shí)間，具有很高的實(shí)用價(jià)值，這也是未來(lái)牛結(jié)核病診斷方法研究的方向之一。

利益沖突：無(wú)