謝瑞燕， 方雪玲， Hamze I.RAGE， 崔彤霞， 朱偉平

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科， 廣東 珠海 519000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy/diabetic kidney disease，DKD)是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因之一，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因，在我國DKD的發(fā)生率逐年增加[1]。長期高血糖引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷破壞了腎小球?yàn)V過屏障的功能及結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生蛋白尿[2]。腎臟慢性缺氧是DKD發(fā)生發(fā)展的重要因素，其中低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在DKD缺氧環(huán)境中扮演著關(guān)鍵的角色[3]。缺氧狀態(tài)下，HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核，在缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)處與 HIF-1β亞基結(jié)合形成二聚體復(fù)合物 HIF-1，HIF-1表達(dá)增加，使機(jī)體提高耐缺氧能力，以適應(yīng)缺氧環(huán)境[4]。高糖能引起缺氧[4]。然而體外模擬高糖環(huán)境，能否造成缺氧環(huán)境，激活HIF途徑，存在爭議[5]。體外高糖能否引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)HIF-1α尚無相關(guān)的研究報(bào)道。

紅景天苷(salidroside，Sal)是薔薇目景天科紅景天的主要活性成分，具有廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)[6]，較多報(bào)道稱，紅景天苷具有保護(hù)心血管和抗缺氧等多種活性[7-9]。近年來，有研究[10]發(fā)現(xiàn)紅景天苷對(duì)改善早期糖尿病腎病患者的臨床療效具有較明顯作用，但對(duì)其作用機(jī)理缺乏深入研究，尤其是從細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)HIF-1α變化方面等相關(guān)因素觀察其保護(hù)作用的研究較少。因此，本研究采用體外高糖誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，在此基礎(chǔ)上觀察高糖狀態(tài)下，紅景天苷對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制，從而為早期糖尿病腎病防治提供新思路和新靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(rat renal glomerular endothelial cells，rRGECs)由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院彭暉教授惠贈(zèng)。紅景天苷(上海同田，批號(hào)10338-51-9)；抗HIF-1α鼠單克隆抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG II 抗(Jackson)；RNA提取試劑盒(Trizol，Invitrogen)；TaKaRa RT-qPCR試劑盒(大連寶生生物)；MTT試劑和D-葡萄糖(D-glucose,D)購自Sigma；胎牛血清(Gibco)；甘露醇(mannitol,M; Amersco)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將rRGECs等量接種于25T培養(yǎng)瓶(Corning)，使用低糖DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每48 h更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞的融合度達(dá)70%～80%開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用無血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理24 h，再分為正常糖(normal glucose，NG；5.6 mmol/L葡萄糖)組、高糖(high glucose, HG； 20、30和50 mmol/L葡萄糖)組、高滲(D-glucose+mannitol, DM; 5.6 mmol/L葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇)組及紅景天苷+高糖(Sal+HG；1、5、10、50、100、150和200 μmol/L紅景天苷+20 mmol/L葡萄糖)組。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 (1)觀察不同濃度葡萄糖在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)rRGECs活力的影響，確定高糖誘導(dǎo)缺氧的最佳條件：取對(duì)數(shù)生長期的rRGECs，按照每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中并分成正常糖(5.6 mmol/L)組和高糖(20、30和50 mmol/L)組，每組6個(gè)平行孔。分別于24 h、72 h和120 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)避光37 ℃孵育4 h，小心吸出上清液，加入150 μL DMSO溶解，振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀檢測490 nm的吸光度(A)值。(2)觀察不同濃度紅景天苷在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)rRGECs活力的影響，確定紅景天苷保護(hù)rRGECs的最佳條件：細(xì)胞分為高糖(20 mmol/L)組及紅景天苷(1、5、10、50、100、150和200 μmol/L)+高糖組。其余步驟同上。

2.3RT-qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)和血管內(nèi)皮鈣黏素(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)的mRNA水平 采用氯仿-異丙醇法提取細(xì)胞總RNA。將細(xì)胞按照每孔1×105接種于6孔板，分為4組：正常糖組、高糖組、高滲組及紅景天苷+高糖組。細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，吸走培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的PBS洗滌3次，用TRIzol提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，根據(jù)TaKaRa試劑說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)條件：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由Invitrogen合成。β-actin的上游引物序列為5’-CCACCATGTACCCAGGCATT -3’, 下游引物序列為5’-GAGCCACCAATCCACACAGA-3’,產(chǎn)物為136 bp; HIF-1α上游引物序列為5’-GGATGAGTTCCGAACGTCGA -3’, 下游引物序列為5’-AGATGGGAGCTCACGTTGTG-3’,產(chǎn)物為145 bp; VEGFA的上游引物序列為5’-GGGAGCAGAAAGCCCATGAA-3’, 下游引物序列為5’-CACACAGGACGGCTTGAAGA-3’,產(chǎn)物為115 bp; VE-cadherin的上游引物序列為5’-ACCAGCATGGACCACCTAAG-3’, 下游引物序列為5’-CAGTACAGCCAGGCAGATCA-3’,產(chǎn)物為120 bp。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參照，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算樣本的各個(gè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.4Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的蛋白水平 采用細(xì)胞全蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。各組細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后去培養(yǎng)液，加入4 ℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，用BCA法測定每組細(xì)胞總蛋白濃度。制備12%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣60 μg，進(jìn)行SDS-PAGE，分別加入 I 抗(HIF-1α以1∶500稀釋，內(nèi)參照β-actin以1 ∶1 000稀釋)后，4 ℃孵育過夜。用1×PBST充分洗膜3次后，加入辣根過氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG II 抗(1 ∶40 000)室溫孵育1 h，用1×PBST洗膜3次后，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色劑顯色，最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)ImageJ進(jìn)行半定量分析，目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白的灰度值/內(nèi)參照灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，方差齊時(shí)，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 長期高糖能抑制rRGECs的活力及其功能

MTT結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，與正常糖組相比，高糖(20和30 mmol/L)組rRGECs的活力增加(P<0.05)；培養(yǎng)120 h后，與正常糖組相比，高糖(20、30和50 mmol/L)組rRGECs的活力下降(P<0.05)，其中高糖(30 mmol/L)組的活力最低(P<0.01)，見表1。RT-qPCR結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h和120 h后，與正常糖組相比，高糖(20和30 mmol/L)組rRGECs內(nèi)VE-cadherin的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖1A。上述結(jié)果說明高糖培養(yǎng)rRGECs 24 h已出現(xiàn)細(xì)胞損傷。

2 高糖影響rRGECs內(nèi)HIF-1α的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，與正常糖組相比，高糖(20 mmol/L)組rRGECs內(nèi)表達(dá)HIF-1α的mRNA上調(diào)(P<0.05);培養(yǎng)120 h后，與正常糖組相比，高糖(20、30和50 mmol/L)組rRGECs內(nèi)HIF-1α的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；高滲組與正常糖組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示高糖對(duì)rRGECs細(xì)胞表達(dá)HIF-1α mRNA的影響與滲透壓變化無關(guān)，見圖1B。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，與正常糖組相比，高糖(20 mmol/L)組rRGECs內(nèi)HIF-1α的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖1D。

表1MTT法檢測不同濃度的葡萄糖對(duì)rRGECs細(xì)胞活力的影響

Table 1.The effect of different concentrations of glucose on the viability of rRGECs (%. Mean±SD.n=3)

GroupGlucose(mmol/L)24 h72 h120 hNG5.6100.0±2.2100.0±1.5100.0±2.0HG20120.2±3.0?100.8±3.154.2±2.5?30126.6±2.7?112.8±2.035.6±1.4??50115.5±2.3111.5±2.170.3±1.7?

*P<0.05,**P<0.01vsNG group.

3 高糖影響rRGECs內(nèi)VEGFA的mRNA表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，與正常糖組相比，高糖(20和30 mmol/L)組rRGECs內(nèi)VEGFA的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；培養(yǎng)120 h后，與正常糖組相比，高糖(20、30和50 mmol/L)組 rRGECs內(nèi)VEGFA的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖1C。

4 紅景天苷能改善高糖對(duì)rRGECs的影響

MTT結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，與高糖(20 mmol/L)組相比，紅景天苷(50 μmol/L)組中rRGECs的細(xì)胞活力明顯增加 (P<0.01);培養(yǎng)120 h后，紅景天苷組細(xì)胞活力無顯著變化，見圖2。RT-qPCR結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，與高糖組(20 mmol/L)相比，紅景天苷(50 μmol/L)+高糖組rRGECs內(nèi)VE-cadherin的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖3A。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用50 μmol/L的Sal干預(yù)高糖培養(yǎng)的rRGECs。

5 紅景天苷可上調(diào)高糖培養(yǎng)rRGECs中HIF-1α的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，與高糖(20 mmol/L)組相比，紅景天苷(50 μmol/L)+高糖組rRGECs內(nèi)HIF-1α的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，與高糖(20 mmol/L)組相比，紅景天苷(50 μmol/L)+高糖組rRGECs的HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖3B、C。

Figure 1.The effects of high glucose (HG) on the expression of VE-cadherin, HIF-1α and VEGFA in rRGECs. A: the relative mRNA expression of VE-cadherin; B: the relative mRNA expression of HIF-1α; C: the relative mRNA expression of VEGFA; D: Western blot for determining the protein level of HIF-1α. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNG group.

圖1不同濃度葡萄糖對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin、HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

Figure 2.The effect of different doses of salidroside on the viability of high glucose (HG)-induced rRGECs using MTT assays. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHG group.

圖2MTT法檢測不同濃度的紅景天苷對(duì)rRGECs細(xì)胞活力的影響

討 論

腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的重要機(jī)制[11]。VE-cadherin是內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要標(biāo)志[12]。Singh等[13]認(rèn)為高糖通過損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖萼，使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。已有研究證明， DKD早期就存在腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，隨著病情的進(jìn)展，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的程度較早期更嚴(yán)重[14]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)24 h和120 h后， rRGECs內(nèi)VE-cadherin的mRNA表達(dá)均下調(diào)。

慢性缺氧在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，能引起細(xì)胞表達(dá)HIF-1α增多，進(jìn)而激活HIF調(diào)節(jié)的下游因子如VEGF和紅細(xì)胞生成素等的轉(zhuǎn)錄，改善組織和細(xì)胞的缺氧狀態(tài)[15]。已有研究報(bào)道，糖尿病動(dòng)物模型中，HIF-1α表達(dá)增加在分離的大鼠心臟和腎臟都能檢測出來[16]。然而，體外高糖培養(yǎng)細(xì)胞能否引起細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增加存在爭議。既往的大部分研究認(rèn)為體外高糖培養(yǎng)細(xì)胞不能引起細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)。Vordermark等[4]研究認(rèn)為，僅僅給予高糖培養(yǎng)細(xì)胞不足以激活HIF途徑。Malhotra等[17]認(rèn)為高糖促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1表達(dá)增多，損害HIF-1α的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)HIF通過泛素-蛋白酶體途徑降解。本研究發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)24 h后，rRGECs的活力增加，HIF-1α的mRNA和蛋白及VEGFA的mRNA表達(dá)均增加。高糖能引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[18]。Klimova等[19]認(rèn)為ROS能通過促進(jìn)脯氨酸羥化酶的降解，進(jìn)而穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)。同時(shí)，有報(bào)道認(rèn)為高糖能提高細(xì)胞胞漿NADH/NAD+的比例，增加一氧化氮的生成，增加細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)[20-21]。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)120 h后，rRGECs的細(xì)胞活力下降， HIF-1α和VEGFA mRNA表達(dá)下調(diào)。這可能與長期高糖刺激rRGECs，導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損有關(guān)。因此，推測rRGECs內(nèi)HIF-1α的表達(dá)情況可能與細(xì)胞活力、葡萄糖濃度、培養(yǎng)時(shí)間及HIF/VEGF通路有關(guān)。

Figure 3.The effects of salidroside (Sal) on the expression of VE-cadherin and HIF-1α in high glucose (HG; 20 mmol/L glucose)-induced rRGECs. A: the relative mRNA expression of VE-cadherin; B: the relative mRNA expression of HIF-1α; C: Western blot for determining the protein level of HIF-1α. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHG group.

圖3不同濃度紅景天苷對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin和HIF-1α表達(dá)的影響

Zheng等[22]認(rèn)為紅景天苷能夠抑制HIF-1α蛋白的降解，使人腎成纖維細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)增多，進(jìn)而激活紅細(xì)胞生成素的表達(dá)，增強(qiáng)造血功能。Guo等[23]研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能通過增加成骨細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)，改善骨質(zhì)疏松的缺氧情況。有報(bào)道[24]認(rèn)為紅景天苷能通過降低HIF-1α蛋白的表達(dá)，改善缺氧狀態(tài)下的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況。本研究采用多個(gè)濃度梯度的紅景天苷干預(yù)高糖組的rRGECs，發(fā)現(xiàn)紅景天苷的濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)，能使rRGECs內(nèi)表達(dá)VE-cadherin的mRNA增加，并非紅景天苷的作用于rRGECs的濃度越高，保護(hù)效果就越強(qiáng)，這與以往的報(bào)道[25]不同。因此，我們認(rèn)為紅景天苷濃度過低，則達(dá)不到最小有效保護(hù)濃度，濃度過高，則有可能對(duì)細(xì)胞造成損傷。當(dāng)紅景天苷濃度為50 μmol/L時(shí)，rRGECs出現(xiàn)活力增加，細(xì)胞功能標(biāo)志物VE-cadherin的mRNA表達(dá)上調(diào)；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)增加，可能與紅景天苷誘導(dǎo)rRGECs內(nèi)HIF-1α轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活rRGECs表達(dá)HIF-1α有關(guān)[3]，所以認(rèn)為紅景天苷能減輕高糖誘導(dǎo)rRGECs損傷，其機(jī)制可能與rRGECs內(nèi)HIF-1α表達(dá)增加有關(guān)。