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      PTSD大鼠海馬CA1區(qū)和前額葉皮層突觸小泡蛋白的表達(dá)*

      2019-02-28 09:18:24師瑞紅
      中國病理生理雜志 2019年2期
      關(guān)鍵詞:小泡陽性細(xì)胞海馬

      林 玲, 高 麗, 師瑞紅

      (河南醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校生理教研室, 河南 鄭州 451191)

      創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是指個體經(jīng)歷、目睹或遭遇到一個或多個涉及自身或他人的實際死亡、受傷,或軀體完整性受到嚴(yán)重威脅,所導(dǎo)致的個體延遲出現(xiàn)并持續(xù)存在的一種精神障礙,以認(rèn)知功能減弱為主要特征[1-2],在臨床上主要表現(xiàn)為病理性重視、持續(xù)性警覺性增高和回避[3]。PTSD已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康甚至是生命的重要疾病之一,近年來雖受到廣泛關(guān)注,但其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。有研究表明,在精神應(yīng)激的過程中,多個腦區(qū)參與了對機(jī)體功能的調(diào)節(jié),包括大腦皮質(zhì)、海馬(hippocampus,Hippo)、杏仁核和下丘腦等。以往有關(guān)PTSD及機(jī)制的研究主要集中在海馬,但在前額葉皮層(prefrontal cortex,PFC)上的研究相對較少。本實驗選擇海馬CA1區(qū)和PFC為共同靶點(diǎn),通過行為學(xué)檢測PTSD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,免疫組化、Western blot和免疫熒光檢測突觸小泡蛋白(synaptophysin)的表達(dá),探討PTSD大鼠空間記憶損傷的機(jī)制。

      材 料 和 方 法

      1 材料

      1.1實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,SPF級,體質(zhì)量180~220 g,購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,合格證號: SCXK(湘)2011-0003。動物飼養(yǎng)環(huán)境:通風(fēng),自然光照環(huán)境,室溫維持在(22±1) ℃。

      1.2主要試劑 兔抗突觸小泡蛋白多克?、窨官徸訟bcam;HRP標(biāo)記的羊抗兔甘油 II 抗、FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光 II 抗、Triton X-100、 BSA和DAB顯色試劑盒等均購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

      1.3實驗儀器 Morris水迷宮(北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制);熒光顯微鏡和冰凍切片機(jī)(OLYMPUS);高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN);轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀(北京六一儀器廠)。

      2 方法

      2.1實驗動物分組 實驗動物隨機(jī)分為正常對照(control)組和模型(model)組,每組18只。常規(guī)分籠飼養(yǎng),每籠6只,采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng),充足水分供應(yīng)。

      2.2PTSD動物模型的制備 按照文獻(xiàn)[4]的方法,模型組大鼠遭遇單次延長應(yīng)激(single prolonged stress, SPS):禁錮2 h;強(qiáng)迫性游水20 min(水深40 cm、水溫25 ℃);休息15 min后乙醚麻醉至意識喪失。2組動物無干擾飼養(yǎng),常規(guī)攝食飲水,飼養(yǎng)溫度為18~22 ℃。

      2.3行為學(xué)測試 造模完成之后24 h行Morris水迷宮實驗,分為前5 d的定位航行實驗與第6天的空間搜索實驗:(1)定位航行實驗:歷時5 d,每天1次,記錄大鼠找到水下平臺的時間(即逃避潛伏期),超過120 s找不到平臺的,可引導(dǎo)其找到平臺,成績記為120 s。(2)空間搜索實驗:實驗第6天撤去水下平臺,大鼠于固定象限面向池壁入水,記錄120 s內(nèi)平臺所在象限的游泳時間和穿越平臺的次數(shù)。

      2.4免疫組化實驗 水迷宮實驗結(jié)束后各組取6只大鼠進(jìn)行免疫組化實驗。大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg)后,經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌注,快速取腦后固定,常規(guī)石蠟包埋,冠狀切片,片厚3 μm,切片常規(guī)脫蠟,蒸餾水沖洗,PBS沖洗3次,每次5 min,用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù),于新配制的0.3% H2O2溶液中室溫下孵育10 min,PBS沖洗3次,每次5 min,滴加兔抗突觸小泡蛋白多克隆抗體(1∶500),4 ℃孵育過夜,PBS沖洗, DAB顯色,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察,攝片。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞的平均積分吸光度值。

      2.5Western blot實驗 各組另取1/3大鼠(6只)在行為學(xué)實驗完畢之后進(jìn)行Western blot實驗。實驗大鼠在腹腔麻醉后快速取出全腦,冰浴分離出海馬,RIPA充分裂解提取蛋白,BCA蛋白定量試劑盒(Novagen)測定蛋白濃度。調(diào)節(jié)各組蛋白濃度統(tǒng)一為0.5 g/L,加2×SDS上樣緩沖液,99 ℃變性10 min。每孔中加10 μL樣品,Tris-SDS PAGE轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入抗突觸小泡蛋白抗體4 ℃過夜。傾去 I 抗,TBST洗膜3次,每次15 min。分別加入滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG II 抗(1∶2 000),置于搖床上搖動,室溫下1 h;棄去II抗,TBST洗膜3次,每次15 min;ECL顯色,凝膠成像分析系統(tǒng)成像,檢測蛋白質(zhì)印跡條帶,Image J軟件分析求得平均吸光度值,以目的條帶與β-actin的吸光度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

      2.6免疫熒光實驗 各組取最后1/3大鼠進(jìn)行免疫熒光實驗。將各組大鼠灌注后取腦,置于4% 多聚甲醛溶液中過夜,經(jīng)30%蔗糖溶液脫水后,用恒溫(-20 ℃)冰凍切片機(jī)作冠狀切片,厚度30 μm,隔 4片取 1片腦片,切片經(jīng)0.3% Ttiton X-100通透2 h,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,10% BSA封閉1 h,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。滴加突觸小泡蛋白I抗,4 ℃條件下孵育過夜; 復(fù)溫后0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。暗室加入FITC標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min, DAPI染核,防淬滅的封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍片,每張切片檢測海馬CA1區(qū)平均陽性細(xì)胞數(shù)和積分吸光度(integral absorbance,IA; IPP 6.0軟件分析)。

      3 統(tǒng)計學(xué)處理

      所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,經(jīng)SPSS 24.0處理,數(shù)據(jù)分析前經(jīng)正態(tài)性分布檢驗,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 不同組別大鼠定位航行實驗和空間搜索實驗成績的比較

      Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示,在定位航行實驗中,從實驗第2天開始到第5天,與對照組比較,模型組大鼠逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)。在空間搜索實驗中,與對照組比較,模型組大鼠在目標(biāo)象限的停留時間均明顯降低(P<0.01),穿越原平臺位置的次數(shù)也明顯減少(P<0.01),見表1、2。

      表1 2組大鼠逃避潛伏期的比較

      **P<0.01vscontrol group.

      表22組大鼠目標(biāo)象限停留時間和穿越原平臺次數(shù)的比較

      Table 2.Comparison of the target quadrant stay time and the times of crossing the platform in the 2 groups (Mean±SD.n=18)

      GroupTarget quadrant stay time (s)Times of crossing the platformControl58.72±6.3512.65±1.74Model42.56±7.43??8.33±1.28??

      **P<0.01vscontrol group.

      2 免疫組化實驗檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

      結(jié)果顯示,在海馬CA1區(qū)和PFC,胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為突觸小泡蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞;與對照組比較,模型組大鼠海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)均顯著減少,積分吸光度均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見圖1。

      3 Western blot實驗檢測2組大鼠海馬和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

      結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠海馬CA1區(qū)和前額葉皮層突觸小泡蛋白的表達(dá)均顯著減少(P<0.05或P<0.01),見圖2。

      4 免疫熒光實驗檢測2組大鼠海馬和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

      熒光顯微鏡下,海馬CA1區(qū)和PFC的神經(jīng)元胞漿內(nèi)可見FITC標(biāo)記的綠色熒光免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為突觸小泡蛋白。對照組大鼠突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞熒光染色強(qiáng),模型組大鼠突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞熒光染色淺,見圖3A、B。在海馬和PFC,與對照組比較,模型組大鼠突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞數(shù)均呈顯著減少,積分吸光度呈顯著降低(P<0.05或P<0.01),見圖3C、D。

      Figure 1.The expression of synaptophysin in the CA1 region of hippocampus and PFC of the rats in the 2 groups was detected by immunohistochemical staining. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

      圖1免疫組化實驗檢測2組大鼠海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)

      Figure 2.The expression of synaptophysin in the CA1 region of hippocampus and PFC of the rats in the 2 groups was detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

      圖2Westernblot實驗檢測2組大鼠突觸小泡蛋白在海馬CA1區(qū)和前額葉皮層的表達(dá)

      討 論

      正常機(jī)體能夠?qū)Ω鞣N環(huán)境因素的復(fù)雜變化作出適應(yīng)性反應(yīng),以適應(yīng)各種應(yīng)激,如果適應(yīng)能力下降就會導(dǎo)致各種疾病。PTSD是一種典型的應(yīng)激障礙性疾病,其臨床表現(xiàn)以再度體驗創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為,是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[5-6]。

      在本研究中,我們利用SPS構(gòu)建PTSD大鼠模型,在Morris水迷宮實驗中,模型組大鼠的逃避潛伏期較對照組明顯延長,撤去水下平臺之后,模型組大鼠目標(biāo)象限游泳時間明顯減少,穿越原平臺位置的次數(shù)也明顯減少,說明了PTSD大鼠的空間記憶能力明顯減退,這些都符合PTSD 的臨床特征,說明模型復(fù)制成功。

      本課題組既往的研究表明,PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退與海馬5-HT1A受體表達(dá)明顯增加以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白PSD-95的表達(dá)明顯減少密切相關(guān)[7]。

      Figure 3.The expression of synaptophysin in CA1 region of hippocampus (A) and PFC (B) of the rats in the 2 groups was observed by immunofluorescence, and the number of the synaptophysin positive cells (C) andIAvalues of synaptophysin (D) were determined. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

      圖3免疫熒光實驗檢測2組大鼠在海馬CA1區(qū)和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)、突觸小泡蛋白陽性細(xì)胞計數(shù)和突觸小泡蛋白平均積分吸光度的比較

      但是有沒有其他蛋白質(zhì)也參與了PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的減退呢?突觸小泡蛋白是突觸前膜囊泡上的一種膜蛋白,是突觸囊泡中含量最為豐富的蛋白之一,它擔(dān)負(fù)著神經(jīng)遞質(zhì)的包裝、儲存、調(diào)節(jié)及釋放。大量研究表明,突觸小泡蛋白表達(dá)的增加能夠增強(qiáng)大鼠的空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力[8-9]。在本實驗中,通過免疫組化、Western blot和免疫熒光實驗檢測了PTSD大鼠海馬和PFC突觸小泡蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,PTSD大鼠均較對照組顯著減少,這可能也是導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶能力減退的原因之一。

      PFC在學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知行為中也具有非常重要的作用[10-11],但以往關(guān)于PTSD發(fā)病機(jī)制的研究在額葉皮層上相對較少。在本實驗中,PTSD模型大鼠PFC突觸小泡蛋白的表達(dá)較正常大鼠顯著減少,這與Campos等[12]和Carvalho-Netto等[13]的研究結(jié)果是一致的。研究表明,急性創(chuàng)傷性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的表達(dá)明顯增加[14-15]。這可能是創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙導(dǎo)致腦內(nèi)促凋亡蛋白的表達(dá)增加,加速了神經(jīng)元的凋亡,進(jìn)而使學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)減少,最終導(dǎo)致大鼠的空間認(rèn)知能力減退。

      也有研究表明,在海馬CA1區(qū)和PFC之間有一個CA1-mPFC網(wǎng)絡(luò)環(huán)路,此環(huán)路通過多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)應(yīng)激性抑郁的認(rèn)知功能障礙[16]。故可作如下推測:在PTSD的大鼠模型中,當(dāng)大鼠接受創(chuàng)傷性刺激之后,激活腦內(nèi)的5-HT遞質(zhì)系統(tǒng),使海馬神經(jīng)元損傷甚至是凋亡及壞死,突觸前膜突觸小泡蛋白的合成及釋放也減少,再通過海馬與PFC之間的神經(jīng)環(huán)路,進(jìn)而導(dǎo)致PFC學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白突觸小泡蛋白的表達(dá)減少,突觸可塑性的功能減退,最終導(dǎo)致大鼠的空間記憶能力減退。但是創(chuàng)傷后應(yīng)激所致認(rèn)知行為障礙的具體機(jī)制,還有待做更加深入的研究。

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