CUDC-907誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA損傷與自噬的實驗研究*

焦 鵬， 黃振州， 張曉靜， 龍妍君， 李召君, 3， 王鳳澤△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1生命科學(xué)研究中心,2生命科學(xué)學(xué)院, 3藥學(xué)院， 山東 泰安 271016)

腦瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生存與健康的疾病。近幾年，我國每年新增腦部腫瘤病例約10萬，其中死亡人數(shù)約6.1萬[1]。在原發(fā)性腦腫瘤中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤約占50%，是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一。目前，手術(shù)治療及術(shù)后輔以放療或化療仍然是膠質(zhì)瘤主要的臨床治療手段[2-3]。腦腫瘤侵襲性很高，大多呈浸潤性，腫瘤組織邊界模糊，手術(shù)很難做到完全切除，復(fù)發(fā)率依然居高不下[4]。另外，放療的副作用較大，患者生活質(zhì)量差。因此，尋求毒副反應(yīng)小且經(jīng)濟(jì)安全的新型藥物成為現(xiàn)階段膠質(zhì)瘤治療的新趨勢。

CUDC-907是一種新型組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)雙靶點抑制劑，能夠有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，在淋巴瘤等實體瘤中呈現(xiàn)良好的生物活性，同時能夠逆轉(zhuǎn)鉑類抗腫瘤藥物的耐藥性[5-7]。本研究以人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞為實驗對象，檢測CUDC-907對U251細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞周期的影響，同時探討CUDC-907誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與DNA損傷的相關(guān)性，為治療神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病提供新思路。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

CUDC-907購自Selleck Chemicals；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、氯喹(chloroquine，CQ)和抗β-actin抗體購自Sigma；抗p70核糖體蛋白S6激酶(p70 ribosomol protein S6 kinase, p70s6K)、p53、細(xì)胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2, Cdc2)和p21抗體購自Santa Cruz；抗Akt、p-p70s6K和p-Cdc2抗體購自Cell Signaling Technology；抗p-Akt和γ-H2AX 抗體購自Abcam；HRP 標(biāo)記的II抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光II 抗購自Thermo Fisher。

2 實驗方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購于上海中科院細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 接種U251細(xì)胞于96孔板中，用不同劑量(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5和5 μmol/L)的CUDC-907處理24 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO并振蕩5 min，在490 nm波長下測定吸光度(A)值，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 不同濃度的CUDC-907作用細(xì)胞24 h后，胰酶消化并收集細(xì)胞，然后加入預(yù)冷的75%無水乙醇，于-20 ℃固定過夜。800 r/min 離心5 min，棄上清后用PBS洗細(xì)胞2次；加入RNase A 于37 ℃ 孵育30 min；然后加入PI避光染色10 min，上機(jī)檢測分析各組細(xì)胞的周期分布。

2.4Western blot實驗 U251細(xì)胞經(jīng)CUDC-907作用24 h 后，PBS洗滌2次，用預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑)冰上裂解20 min,13 000 r/min離心 20 min，收集上清并用BCA法定量。取約30 μg的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h， 加入I抗4 ℃孵育過夜，然后加入II抗室溫孵育1 h，用ECL 顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

2.5免疫熒光染色 接種細(xì)胞至放有蓋玻片的6 孔板進(jìn)行爬片培養(yǎng)，然后用不同濃度的CUDC-907處理細(xì)胞24 h。PBS洗滌玻片2 次， 4%多聚甲醛室溫固定20 min，Triton X-100 破膜后用山羊血清室溫封閉30 min，加入小鼠抗人γ-H2AX 單克隆抗體于室溫孵育2 h，再加入熒光II 抗37 ℃避光孵育1 h，DAPI染色5 min并封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的綠色灶點即為γ-H2AX焦點，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。

2.6GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光檢測 接種U251細(xì)胞于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80%左右時，用Lipfectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染方法參照說明書。轉(zhuǎn)染6 h 后換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，用不同濃度的CUDC-907處理細(xì)胞24 h，對照組加入DMSO。倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察實驗結(jié)果，并拍照分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CUDC-907抑制 U251細(xì)胞活力

MTT實驗結(jié)果顯示，不同濃度CUDC-907處理U251細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力均顯著下降，半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)=1.84 μmol/L，且其對細(xì)胞活力的抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1。

2 CUDC-907抑制PI3K/Akt信號通路

本研究首先檢測CUDC-907對PI3K/Akt信號通路的影響。Western blot實驗結(jié)果表明，在CUDC-907處理的細(xì)胞中，Akt和p70s6K的磷酸化水平較對照組明顯降低(P<0.05),見圖2，表明CUDC-907能夠顯著抑制PI3K/Akt信號通路。

Figure 1.The inhibitory effect of CUDC-907 on the viability of U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1CUDC-907抑制U251細(xì)胞活力

3 CUDC-907增加細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點的生成

為了確定CUDC-907是否誘導(dǎo)DNA發(fā)生損傷，本研究檢測了CUDC-907對U251細(xì)胞內(nèi)DNA損傷標(biāo)志分子γ-H2AX焦點數(shù)目的影響。從結(jié)果中可以看出，U251細(xì)胞經(jīng)CUDC-907作用后，γ-H2AX的焦點數(shù)目明顯增多(P<0.05)，表明CUDC-907可誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂，見圖3。用Western blot實驗檢測了CUDC-907對γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在CUDC-907處理的細(xì)胞中，γ-H2AX呈高表達(dá)趨勢(P<0.05)，進(jìn)一步說明CUDC-907對U251細(xì)胞DNA損傷的誘導(dǎo)作用,見圖4。

4 CUDC-907誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯

采用流式細(xì)胞術(shù)觀察了CUDC-907對U251細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，CUDC-907處理U251細(xì)胞24 h后，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而S期的細(xì)胞數(shù)量則相應(yīng)減少(P<0.05),見圖5。

Figure 2.CUDC-907 inhibited the phosphorylation of Akt and p70s6K in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2CUDC-907抑制Akt和p70s6K的磷酸化

Figure 3.Assessment of CUDC-907-induced DNA damage in U251 cells through an immunofluorescence γ-H2AX focus assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖3CUDC-907誘導(dǎo)U251細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點的生成

Figure 4.The effect of CUDC-907 on the protein expression of γ-H2AX in the U251 cells was determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4Westernblot檢測γ-H2AX的蛋白表達(dá)

Western blot實驗檢測了CUDC-907對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)及活性的影響,結(jié)果可見，U251細(xì)胞經(jīng)CUDC-907處理24 h后，p21的蛋白表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞周期素B1(cyclin B1)的表達(dá)則受到抑制，但p53表達(dá)水平未見明顯變化，同時Cdc2的磷酸化水平明顯降低(P<0.05),見圖6。

5 抑制自噬促進(jìn)CUDC-907誘導(dǎo)的DNA損傷

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞自噬體膜，形成明亮的綠色斑點。轉(zhuǎn)染GFP-LC3 質(zhì)粒的U251細(xì)胞經(jīng)CUDC-907處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)呈點狀分布的GFP-LC3融合蛋白表達(dá)增加，表明CUDC-907 能夠促進(jìn)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，見圖7。Western blot實驗結(jié)果表明，與對照組相比，CUDC-907處理組LC3-II/LC3-I比例明顯增加(P<0.05)，進(jìn)一步說明CUDC-907能夠誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生自噬,見圖8。

自噬影響細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)過程[8]。當(dāng)采用自噬抑制劑氯喹(10 μmol/L)與CUDC-907(0.1 μmol/L)聯(lián)合處理細(xì)胞后，Western blot實驗發(fā)現(xiàn)γ-H2AX的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，說明抑制自噬促進(jìn)了CUDC-907誘導(dǎo)的DNA 損傷應(yīng)答,見圖9。

Figure 5.The effect of CUDC-907 on the cell cycle distribution in U251 cells was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5CUDC-907對U251細(xì)胞周期的影響

討 論

在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/Akt信號通路發(fā)揮著極為重要的作用，能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長與侵襲轉(zhuǎn)移等過程[9]；同時，該信號途徑還參與調(diào)控細(xì)胞自噬及腫瘤放化療敏感性等[10]。組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎検且环N動態(tài)平衡過程，在染色體結(jié)構(gòu)修飾及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性中發(fā)揮著重要作用。組蛋白的乙?；潭仁怯山M蛋白轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；竻f(xié)調(diào)控制[11]。腫瘤細(xì)胞中的HDAC 常過量表達(dá)，致使組蛋白過度乙?；?，導(dǎo)致核小體結(jié)構(gòu)變得緊密，使得轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而引發(fā)腫瘤[12]。

Figure 6.The effect of CUDC-907 on the expression of cell cycle regulatory proteins in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖6CUDC-907對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 7.The expression of GFP-LC3 in the U251 cells transfected with GFP-LC3 plasmid. After transfection for 24 h, the cells were treated with CUDC-907 at different concentrations for another 24 h.

圖7CUDC-907對U251細(xì)胞中GFP-LC3融合蛋白表達(dá)的影響

Figure 8.Treatment of CUDC-907 increased the expression of LC3-II in the U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖8CUDC-907促進(jìn)自噬標(biāo)志分子LC3-II的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)HDAC和PI3K雙重抑制劑CUDC-907能夠有效抑制U251細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路，同時誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答。DNA損傷應(yīng)答是細(xì)胞應(yīng)對外界不利影響的一種防御性反應(yīng)，當(dāng)DNA 損傷應(yīng)答發(fā)生時，常伴隨著細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯等[13]。我們的研究結(jié)果表明，不同濃度的CUDC-907處理U251細(xì)胞后，DNA損傷應(yīng)答標(biāo)志分子γ-H2AX 的焦點數(shù)量增多，同時γ-H2AX的表達(dá)水平升高，表明CUDC-907能夠誘導(dǎo)U251 細(xì)胞發(fā)生DNA 損傷應(yīng)答。

DNA 損傷發(fā)生后，細(xì)胞往往通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程而修復(fù)損傷的DNA，如果DNA受損嚴(yán)重則細(xì)胞走向凋亡或壞死。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，CUDC-907作用U251細(xì)胞后，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明CUDC-907能夠誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，且在CUDC-907處理的U251細(xì)胞中，p21蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，而cyclin B1的蛋白表達(dá)則下調(diào)，同時Cdc2的磷酸化受到抑制，表明CUDC-907誘導(dǎo)的G2/M期阻滯可能與其調(diào)控上述細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)與磷酸化修飾相關(guān)。

Figure 9.Suppression of autophagy accelerated CUDC-907-induced γ-H2AX expression. The cells were treated with CUDC-907 at 0.1 μmol/L and/or CQ at 10 μmol/L for 24 h, the protein level of γ-H2AX was determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (untreated cells);#P<0.05vsCUDC-907-treated group.

圖9抑制自噬促進(jìn)CUDC-907誘導(dǎo)的γ-H2AX表達(dá)

細(xì)胞自噬是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，是真核細(xì)胞將細(xì)胞內(nèi)受損、變性和衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種蛋白質(zhì)降解途徑[14]。細(xì)胞自噬與DNA 損傷應(yīng)答關(guān)系密切：一方面，DNA 損傷能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生；另一方面，自噬調(diào)節(jié)多種損傷修復(fù)關(guān)鍵酶的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)受損的DNA[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CUDC-907能夠誘導(dǎo)U251 細(xì)胞發(fā)生自噬。當(dāng)自噬抑制劑氯喹聯(lián)合CUDC-907處理U251細(xì)胞后，γ-H2AX 的表達(dá)水平明顯升高，說明CUDC-907誘導(dǎo)的自噬可能是保護(hù)性自噬。CUDC-907和自噬抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用可能為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新策略。