李若彤

(泰安市中心醫(yī)院病理科， 山東 泰安 271000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellutar carcinoma，HCC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)占所有腫瘤發(fā)病率的第5 位，且發(fā)病率仍在逐年上升。我國是肝癌發(fā)病率最高的國家，2015年患病人數(shù)約46.6萬，而因肝癌死亡的人數(shù)達(dá)到42.2萬人[1]。目前HCC的治療手段主要是手術(shù)和放、化療等，但由于發(fā)病隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已失去手術(shù)時(shí)機(jī)；另外，以外科手術(shù)為主的治療模式預(yù)后仍不盡人意，使得尋找有效治療藥物一直是肝癌研究的熱點(diǎn)[2]。

AZD5363是一種新近合成的Akt抑制劑，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)能夠協(xié)同促進(jìn)LY294002等其它Akt蛋白激酶抑制劑的抗腫瘤活性[3-4]。本研究以肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7為研究對(duì)象，從AZD5363誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與其調(diào)控肝癌細(xì)胞活力和凋亡的相關(guān)性入手，檢測(cè)AZD5363對(duì)HepG2和Huh7細(xì)胞活力、凋亡及自噬的影響，為AZD5363的臨床應(yīng)用及治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7購自上海中科院生命研究所細(xì)胞庫。AZD5363購自Selleck Chemicals；Lipofectamine 2000和胎牛血清購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA片段末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購自Roche；抗多腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]抗體購自Cell Signaling Technology；MTT、氯喹(chloroquine，CQ)和抗β-actin抗體購自Sigma；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自Millipore；II抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，3 d傳代1次。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 胰酶消化HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞并接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后加入不同劑量(1.25、2.5、5、10、20、50和100 μmol/L)的AZD5363處理24 h，對(duì)照(control)組加入含DMSO的完全培養(yǎng)基。終止培養(yǎng)前4 h于各個(gè)孔中加20 μL MTT(5 mg/L)。吸去培養(yǎng)基，加入150 μL的DMSO于室溫振蕩10 min，最后于490 nm波長下測(cè)定各孔吸光度(A)值。以同樣的方法測(cè)平行孔，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，分別用終濃度為0 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L的AZD5363處理細(xì)胞24 h。室溫下用4%甲醇溶液固定細(xì)胞1 h，0.1% Triton X-100處理2 min。按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡染色，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果。同時(shí)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，分為CQ(20 μmol/L)組、AZD5363(50 μmol/L)組和CQ(20 μmol/L)+AZD5363(50 μmol/L)組，處理24 h后，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后，用預(yù)冷RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min， 4 ℃、 12 000 r/min離心25 min，收集上清并用BCA法定量蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，經(jīng)電泳及轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；再用5%脫脂奶粉封閉過夜，加入I抗，室溫過夜孵育后加入II抗，最后ECL顯影液曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5GFP-LC3融合蛋白表達(dá)的觀察 用無血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋GFP-LC3質(zhì)粒和Lipofectamine 2000復(fù)合物，混勻后室溫孵育30 min，然后加入經(jīng)Opti-MEM洗滌后的HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中。在5% CO2孵箱內(nèi)37 ℃ 孵育6 h后，更換新的完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，加入不同濃度的AZD5363繼續(xù)處理24 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AZD5363對(duì)HepG2和HUh7細(xì)胞活力的抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，2種肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度AZD5363作用24 h后，細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05)，表明AZD5363能夠劑量依賴性地抑制細(xì)胞活力，見圖1。

Figure 1.The effect of AZD5363 treatment on the viability of HepG2 and Huh7 cells was determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1AZD5363對(duì)HepG2和Huh7細(xì)胞活力的抑制作用

2 AZD5363誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞凋亡

采用TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了AZD5363對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。從結(jié)果可以看出，較高劑量(20和50 μmol/L)的AZD5363能夠明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05),見圖2。

另外，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20和50 μmol/L AZD5363促進(jìn)了HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞內(nèi)PARP的切割(P<0.05)，見圖3，進(jìn)一步表明AZD5363能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Figure 2.AZD5363 triggered the apoptosis in hepatocellular carcinoma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2AZD5363誘導(dǎo)Huh7和HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡

Figure 3.High doses of AZD5363 triggered Huh7 and HepG2 cell apoptosis via activating the cleavage of PARP. The level of PARP cleavage was determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖3AZD5363誘導(dǎo)Huh7和HepG2細(xì)胞內(nèi)PARP的切割

3 AZD5363誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬

將肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3表達(dá)載體，然后用AZD5363處理細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞自噬的變化。從結(jié)果可見，正常對(duì)照組細(xì)胞中的GFP-LC3 斑點(diǎn)極少，經(jīng)AZD5363處理后，細(xì)胞中的GFP-LC3 斑點(diǎn)顯著增多，說明AZD5363可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞及Huh7細(xì)胞發(fā)生自噬，見圖4。

Figure 4.Microscopic observation of GFP-LC3-II in Huh7 cells and HepG2 cells transiently transfected with GFP-LC3 plasmids cultured for 24 h and then treated with AZD5363 for another 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4AZD5363誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AZD5363作用于HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3-II的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，見圖5。

4 氯喹促進(jìn)AZD5363誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探討自噬與AZD5363誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，本組利用自噬抑制劑氯喹來抑制細(xì)胞中自噬的發(fā)生。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與AZD5363單獨(dú)用藥組相比，抑制自噬能夠顯著增加AZD5363對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用(P<0.05)，見圖6。

TUNEL染色結(jié)果表明，與AZD5363單獨(dú)用藥相比，AZD5363聯(lián)合CQ組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖7。

另外，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，AZD5363與CQ聯(lián)用后促進(jìn)了肝癌細(xì)胞內(nèi)PARP的切割(P<0.05)，見圖8，進(jìn)一步說明AZD5363誘導(dǎo)的自噬對(duì)肝癌細(xì)胞起保護(hù)性作用。

討 論

本課題組前期通過研究發(fā)現(xiàn)，AZD5363能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其在肝癌細(xì)胞中的抑制活性尚未報(bào)道[5]。本研究首先采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了AZD5363對(duì)肝癌細(xì)胞活力的抑制作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度的AZD5363作用肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞活力顯著下降，表明AZD5363能夠抑制HepG2和Huh7細(xì)胞活力，且抑制作用呈劑量依賴性。

Figure 5.The results of Western blot analysis of LC3-II in the Huh7 cells and HepG2 cells treated with the indicated concentrations of AZD5363 for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5AZD5363對(duì)HepG2和Huh7細(xì)胞中LC3-II表達(dá)的影響

Figure 6.Blockage of autophagy by CQ promoted AZD5363-suppressed viability of the hepatocellular carcinoma cells. The cell viability was determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (untreated cells);#P<0.05vsAZD5363 alone group.

圖6抑制自噬增加AZD5363對(duì)肝癌細(xì)胞活力的抑制作用

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物抑癌活性的理論依據(jù)之一[6-7]。我們采用TUNEL標(biāo)記法檢測(cè)了AZD5363對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,發(fā)現(xiàn)較高濃度的AZD5363作用細(xì)胞24 h后，HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞均表現(xiàn)不同程度的凋亡。為進(jìn)一步闡明AZD5363促凋亡的可能作用機(jī)制，本研究采用Western blot 法分析了AZD5363對(duì)細(xì)胞內(nèi)PARP 蛋白切割水平的影響。PARP 是存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的一個(gè)多功能蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，是細(xì)胞凋亡核心成員caspase的切割底物，在細(xì)胞和各種刺激因素作用下，活化的caspase通過剪切PARP 成不同的片段而使其不能發(fā)揮正常功能，從而啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡[8]。本研究Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高劑量的AZD5363作用細(xì)胞后，PARP蛋白切割水平增加，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中一種重要的生物學(xué)過程，細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹受損蛋白及細(xì)胞器形成自噬體，并與溶酶體相結(jié)合形成自噬溶酶體，降解其包裹內(nèi)容物，為細(xì)胞代謝提供原料和能量[9]。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，許多研究表明，腫瘤細(xì)胞在化療過程中可激活自噬信號(hào)，作為一種保護(hù)機(jī)制使得細(xì)胞免遭死亡[10]。因此，抑制自噬而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性在目前抗腫瘤治療研究應(yīng)受到重視[11]。

Figure 7.Combined treatment with AZD5363 and chloroquine (CQ) synergistically induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells. The apoptosis was determined by TUNEL staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (untreated cells);#P<0.05vsAZD5363 alone group.

圖7抑制自噬增強(qiáng)AZD5363誘導(dǎo)的Huh7和HepG2細(xì)胞凋亡

為了闡明AZD5363抑制肝癌細(xì)胞活性的內(nèi)在機(jī)制，本研究同時(shí)檢測(cè)了AZD5363對(duì)細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)AZD5363能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬?？紤]到細(xì)胞自噬在調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療效果中的重要作用，我們選取氯喹作為自噬抑制劑，探討AZD5363誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬的相關(guān)性。當(dāng)肝癌細(xì)胞用CQ處理后，可明顯增強(qiáng)AZD5363對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用，同時(shí)促進(jìn)AZD5363誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明抑制自噬增強(qiáng)AZD5363對(duì)HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞的殺傷活性，自噬在AZD5363處理的肝癌細(xì)胞中起保護(hù)作用。

綜上所述，本研究探討了AZD5363對(duì)人肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞凋亡與自噬的影響，發(fā)現(xiàn)AZD5363能夠通過抑制細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺傷肝癌細(xì)胞，同時(shí)激活細(xì)胞了保護(hù)性自噬，抑制自噬促進(jìn)了AZD5363的抗腫瘤活性。本研究為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供新思路。

Figure 8.The protein levels of cleaved PARP and LC3-Ⅱ after combined treatment with AZD5363 and chloroquine (CQ) were analyzed by Western blot analysis. β-actin was used as an equal loading control. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (untreated cells);#P<0.05vsAZD5363 alone group.

圖8抑制自噬增強(qiáng)AZD5363誘導(dǎo)的PARP切割