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      吡咯烷螺二吲哚對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞活力及凋亡的影響*

      2019-02-28 09:12:50馬金珠昝嘉偉張根葆
      中國病理生理雜志 2019年2期
      關(guān)鍵詞:吡咯烷吲哚衍生物

      馬金珠, 顏 亮, 昝嘉偉, 徐 蕾, 王 毅, 張根葆△

      (1安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心, 2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 安徽 蕪湖 241002; 3南京大學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210023)

      非小細(xì)胞肺癌占肺癌總發(fā)病率的85%,因其預(yù)后差[1]和死亡率高占據(jù)腫瘤死亡率的第二位[2],僅次于肝癌。非小細(xì)胞癌的病理機制極為復(fù)雜,目前還缺乏有效的靶位藥對其進(jìn)行有效治療,5年存活率低于15%[3]。因此,對非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機理進(jìn)行研究,并開發(fā)出新的靶向治療藥物對于非小細(xì)胞肺癌的治療至關(guān)重要。

      化學(xué)合成藥物是進(jìn)行藥物創(chuàng)新的重要方式之一。該方法先通過對先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)所提供的信息進(jìn)行合成,再對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化或合成相關(guān)類似物,因而可能發(fā)現(xiàn)新的低毒性有效的藥物候選物[4]。在過去的幾年中,螺旋吲哚類衍生物以構(gòu)造一個手性季碳中心的合成方法取得了重要的進(jìn)展,如通過不對稱的分子內(nèi)赫克反應(yīng),高選擇性地合成了螺-吡咯-3, 3′-吲哚衍生物[5]。 此外,通過吲哚與氨基酸脂和靛紅的級聯(lián)反應(yīng)[6]也可以高效得到螺旋吲哚衍生物。到目前為止,多數(shù)研究主要集中在螺旋吲哚類衍生物在合成方法及效率等方面,而對于螺旋吲哚衍生物的生物學(xué)活性尤其是抗腫瘤活性的研究還很少。 鑒于對螺旋吲哚衍生物在抗腫瘤藥物的篩選領(lǐng)域研究的重要性,本研究觀察了新合成的吡咯烷螺二吲哚(proline-spirooxindole,PSx)對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響,初步探討螺旋吲哚類衍生物的潛在抗腫瘤活性。

      材 料 和 方 法

      1 材料

      人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。吡咯烷螺二吲哚為南京大學(xué)化工學(xué)院合成,結(jié)構(gòu)式見圖1A;胎牛血清購自Gibco;CCK-8試劑盒購自凱基生物科技公司;Anne-xin V/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自BD;DAPI染料購自廣州銳博生物科技公司;鼠源抗p53、多ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]和mTOR抗體購自Cell Signaling Technology;抗GAPDH抗體和兔抗鼠 II 抗購自Santa Cruz。

      2 方法

      2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549用含10%胎牛血清和抗生素(1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5%的CO2的環(huán)境下培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

      2.2Western blot檢測細(xì)胞信號蛋白 經(jīng)藥物處理24 h后,收集各組細(xì)胞裂解物。4 ℃、12 000×g離心5 min,取上清。BCA法測定每個樣品的蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min,冷卻后,按照定量濃度,每孔上樣量為40 μg進(jìn)行上樣。經(jīng)SDS-PAGE(10%)分離后,將蛋白全部轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜放入用TBST配制的5% 脫脂奶封閉液中,室溫封閉1 h。然后加入按照1 ∶1 000稀釋的 I 抗,4 ℃孵育過夜。再用TBST清洗6次,每次5 min。加入稀釋好的 II 抗,室溫孵育1 h,TBST清洗6次,每次5 min。清洗好的膜放入暗盒上,正面朝上,加入顯影液,檢測蛋白。

      2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549按照每孔1×104的密度接種于96孔板中,用不同濃度(25、50和100 mg/L)的吡咯烷螺二吲哚處理細(xì)胞24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑(2.5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定每孔的吸光度(A)值。

      2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗A549細(xì)胞2次,1 000 r/min離心收集細(xì)胞,用100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,然后分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI,室溫避光孵育20 min,再加入1×Binding Buffer 400 μL。流式細(xì)胞儀檢測,根據(jù)陰性對照組進(jìn)行設(shè)門及調(diào)節(jié)電壓,隨后分析細(xì)胞凋亡率,每次計數(shù)1×104個細(xì)胞。

      3 統(tǒng)計學(xué)處理

      采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 PSx抑制A549細(xì)胞活力

      使用不同濃度的PSx預(yù)處理A549細(xì)胞24 h,CCK-8法檢測細(xì)胞活力,實驗結(jié)果顯示,隨著PSx濃度的增加,A549細(xì)胞活力被顯著抑制,并呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.01),見圖1B。為了觀察PSx對A549 細(xì)胞形態(tài)的影響,使用倒置顯微鏡觀察并采集細(xì)胞圖像,結(jié)果顯示,相比于DMSO對照組,隨著PSx濃度的增加,A549細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的脫落和減少,見圖2。這些結(jié)果表明PSx對A549細(xì)胞活力具有顯著抑制作用。

      2 PSx誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

      使用25、50和100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h,Annexin V/PI雙染細(xì)胞,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞的凋亡率,實驗結(jié)果顯示,隨著PSx濃度的增加,A549的細(xì)胞的存活率被顯著抑制,并呈現(xiàn)劑量依賴性,而細(xì)胞凋亡率也顯著上升(P<0.05或P<0.01),表明PSx可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,見圖3。此外,使用25、50和100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h后,使用核酸染料DAPI 對A549細(xì)胞進(jìn)行染色,結(jié)果顯示,在340 nm激發(fā)波長下,PSx處理的A549細(xì)胞有典型的核固縮的細(xì)胞凋亡形態(tài),見圖4。

      Figure 1.The chemical structure (A) of proline-spirooxindole (PSx) and its effect on the viability of A549 cells (B). Mean±SD.n=5.**P<0.01vsDMSO group.

      圖1PSx的化學(xué)結(jié)構(gòu)及對A549細(xì)胞活力的影響

      Figure 2.The effect of proline-spirooxindole (PSx) on the morphological changes of A549 cells (×200).

      圖2PSx對A549細(xì)胞形態(tài)的影響

      Figure 3.The effect of proline-spirooxindole (PSx) on the apoptosis of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

      圖3PSx對A549細(xì)胞凋亡的影響

      Figure 4.The effect of proline-spirooxindole (PSx) on the morphological changes of the nuclei of A549 cells (×200).

      圖4PSx對A549細(xì)胞核形態(tài)的影響

      3 PSx對凋亡相關(guān)蛋白的影響

      為了驗證PSx對細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響,使用25、50和100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h,Western blot法檢測了A549 細(xì)胞抑癌蛋白p53和DNA修復(fù)酶PARP的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,PSx可以顯著上調(diào)p53的表達(dá),下調(diào)PARP并上調(diào)PARP切割產(chǎn)物的蛋白水平(P<0.01)。此外,使用25、50、100 mg/L PSx處理A549細(xì)胞24 h,檢測mTOR信號蛋白的磷酸化水平,結(jié)果顯示,PSx可以劑量依賴性地抑制mTOR的磷酸化水平(P<0.05),見圖5。

      Figure 5. The effect of PSx on the apoptotis-related proteins in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsDMSO group.

      圖5PSx對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

      討 論

      研究表明,螺旋吲哚類化合物具有多種生物學(xué)活性,如吡咯烷基吲哚類化合物可以抑制人類前列腺癌細(xì)胞的增殖[7-8];吲哚螺環(huán)-吡咯嘧啶類化合物通過抑制AKT的表達(dá),能減緩腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長[9];此外,一些吲哚螺環(huán)化合物可以作為法呢酰基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase,F(xiàn)TIs)抑制劑,有顯著抗腫瘤作用[10],因此螺旋吲哚類衍生物具有潛在的抗腫瘤活性。在本研究中,我們通過氨基酸脂和靛紅的級聯(lián)反應(yīng)得到一種新型的螺旋吲哚衍生物,并評估了其對非小細(xì)胞癌的抑制作用。結(jié)果顯示,該化合物可以直接抑制A549細(xì)胞生長,改變細(xì)胞形態(tài)并誘導(dǎo)A549細(xì)胞核出現(xiàn)典型的細(xì)胞核固縮形態(tài)。此外,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測了Annexin V/PI雙染的A549細(xì)胞,可以也觀察到PSx對其A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

      哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種Ser/Thr蛋白激酶[11-14],作為ATP和氨基酸水平的傳感器來平衡細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì),對于調(diào)控細(xì)胞生長至關(guān)重要[15-17]。mTOR在Ser2448殘基處偶聯(lián)PI3激酶/Akt信號傳導(dǎo)途徑磷酸化,并在Ser2481處自磷酸化[18]。mTOR在細(xì)胞生長和營養(yǎng)平衡中起關(guān)鍵作用,并可能在腫瘤中異常表達(dá)。 因此,mTOR可作為抗腫瘤治療的潛在靶位[19]。本研究檢測了PSx對A549細(xì)胞的mTOR Ser2481位點磷酸化水平的影響,結(jié)果顯示PSx可以有效抑制mTOR的磷酸化,提示mTOR可能是PSx抑制A549細(xì)胞活性的作用靶位。此外,本研究觀察了PSx對抑癌基因TP53產(chǎn)物p53轉(zhuǎn)錄因子的影響。 p53作為DNA損傷的檢查點檢測細(xì)胞損傷情況,其激活可阻滯細(xì)胞周期并進(jìn)行進(jìn)一步的DNA修復(fù),或修復(fù)失敗直接促使細(xì)胞凋亡[20]。PSx可以顯著誘導(dǎo)p53的表達(dá)及DNA修復(fù)酶發(fā)生切割,我們推測PSx加入后會誘導(dǎo)p53的表達(dá),從而激活相關(guān)凋亡信號通路,進(jìn)而導(dǎo)致DNA修復(fù)酶發(fā)生切割。

      綜上所述,本研究在體外證實了吡咯烷螺二吲哚具有抗非小細(xì)胞肺癌的潛在活性,為該類化合物所具有生物活性的研究提供了實驗依據(jù)。然而,在本實驗中,我們尚未探討該藥物是否會引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓的改變。因為滲透壓的改變對細(xì)胞生長和凋亡會產(chǎn)生影響,在后續(xù)的研究中我們要排除該藥物可能對滲透壓的影響,并進(jìn)一步研究PSx作為抗腫瘤藥物的具體作用機制。

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