李鑫，馬立芝，向國(guó)安，李琦，姬文婕，魏路清

1.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心a.急診科，b.呼吸科，北京100039；2.解放軍總醫(yī)院，北京100853；3.武警特色醫(yī)學(xué)中心 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，天津300162

Krüppel 樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）是包含鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體多項(xiàng)生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。KLF4 是KLFs 家族眾多成員之一，因其在消化道含量豐富又稱為胃腸富集KLF[2]（gut-enriched KLF，GKLF）。KLF4 能夠與不同的靶基因結(jié)合而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄激活或抑制。近年來的研究表明，KLF4 能夠參與并調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[3]。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，參與先天性免疫和細(xì)胞免疫活動(dòng)[4-5]。在不同的內(nèi)環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可分化為具有促炎性的M1型巨噬細(xì)胞或抗炎性的M2 型巨噬細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[6]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)KLF4在博來霉素致肺纖維化過程中呈明顯的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)給予阿托伐他汀（atorvastatin，ATO）干預(yù)后KLF4的表達(dá)也隨之發(fā)生改變[7-8]。為進(jìn)一步探索ATO和KLF4的作用機(jī)制，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型變化，探討KLF4 對(duì)巨噬細(xì)胞表型的變化調(diào)節(jié)與ATO 干預(yù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型RAW264.7細(xì)胞（南開大學(xué)生命科學(xué)院韓際宏教授惠贈(zèng)）；KLF4 過表達(dá)RAW264.7細(xì)胞（Lenti-KLF4）、空載體對(duì)照的RAW264.7細(xì)胞（Lenti-pLVX）（實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存[9-10]）；胎牛血清（Gibco 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（HyClone 公司）；瓊脂糖、阿托伐他?。⊿igma 公司）；嗎啉代丙烷磺酸（Ambion 公司）；PCR 擴(kuò)增試劑盒（大連TaKaRa 公司）；TRIzol 試劑盒、Lipo?fectAMINE 3000 試 劑（Invitrogen 公 司）；SYB?RGreen 實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（Roche 公司）；引物均由中美泰和生物有限公司合成。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

取出野生型RAW264.7細(xì)胞、Lenti-KLF4細(xì)胞、Lenti-pLVX細(xì)胞，迅速?gòu)?fù)蘇后置于含2 mL 12%高糖DMEM 培養(yǎng)基的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×104細(xì)胞，1 mL 12%高糖DMEM 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)21 h，從每孔吸出500 μL 培養(yǎng)基于無菌EP 管中，在實(shí)驗(yàn)組EP 管中加入5 μL LPS 溶液（20 ng/μL），對(duì)照組EP 管中加入5 μL 高糖DMEM 培養(yǎng)基，混勻后加回到原細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.4 ATO 干預(yù)RAW264.7細(xì)胞

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×104細(xì)胞，1 mL 12%高糖DMEM 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h，從每孔吸出500 μL 培養(yǎng)基于無菌EP 管中，在對(duì)照組EP 管中加入10 μL DMSO，實(shí)驗(yàn)組EP 管中加入10 μL ATO 溶液（10 μmol/mL），混勻后加回到原細(xì)胞培養(yǎng)孔中去，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.5 ATO 干預(yù)后，LPS 作用于RAW264.7細(xì)胞

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×104細(xì)胞，1 mL 12%高糖DMEM 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培18 h，從每孔吸出500 μL 培養(yǎng)基于無菌EP 管中，在對(duì)照組及LPS 組EP 管中分別加入10 μL DMSO，LPS+ATO 組EP 管中加入10 μL ATO 溶液（10 μmol/mL），混勻后加回到原細(xì)胞培養(yǎng)孔中去，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，從每孔吸出500 μL 培養(yǎng)基于無菌EP管中，在對(duì)照組EP 管中加入5 μL 高糖DMEM 培養(yǎng) 基，LPS 組 及LPS+ATO 組EP 管 中 加入5 μL LPS 溶液（20 ng/μL），混勻后加回到原細(xì)胞培養(yǎng)孔中去，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.6 RT-PCR 檢 測(cè)KLF4 mRNA的表 達(dá)

每組3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。分別提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,用2-ΔΔCt法分析擴(kuò)增結(jié)果。引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Stata 14.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS、ATO 分別作用于野生型RAW264.7細(xì)胞后KLF4的mRNA表 達(dá)

RT-PCR 結(jié)果見圖1。 LPS誘導(dǎo)野生型RAW264.7細(xì)胞3 h后，KLF4基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比降低約70%（0.24±0.06 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。ATO 干預(yù)野生型RAW264.7細(xì)胞6 h后，KLF4基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比升高約3倍（3.72±0.71 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

2.2 LPS誘導(dǎo)野生型RAW264.7細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞表型相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果見圖2。 LPS誘導(dǎo)野生型RAW264.7細(xì)胞3 h后，與較野生型對(duì)照組相比，IL-10、Arg-1基因的mRNA表達(dá)量分別低于對(duì)照組約84%（0.16±0.02 vs 1.00±0.00）、74%（0.26±0.04 vs 1.00±0.00）（P＜0.05），NF- κB基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高約1.5倍（1.51±0.21 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

2.3 ATO 干預(yù)后，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞表型相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果見圖3。ATO 干預(yù)后LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，ATO+LPS 組與LPS 組（對(duì)照組）相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別高于對(duì)照組約1.6倍（1.70±0.16 vs 1.00±0.00）、1.8倍（1.83±0.08 vs 1.00±0.00，P＜0.05)，NF-κB基因的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低了約42%（0.58±0.05 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

圖1 KLF4的mRNA 相對(duì)表達(dá)

圖2 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.4 LPS誘導(dǎo)Lenti-KLF4細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞表型相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果見圖4。LPS誘導(dǎo)KLF4 過表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞后，LPS 組 中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX 相比IL-10、Arg-1、基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別升高約3倍（1.64±0.09 vs 0.56±0.06，P＜0.01）、16倍（4.30±0.29 vs 0.27±0.11，P＜0.01），NF-κB基因的相對(duì)表達(dá)量降低約60%（1.49±0.30 vs 3.79±0.63，P＜0.05）。在對(duì)照組中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX 相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別升高約3.3倍（3.32±0.94 vs 1.00±0.00，P＜0.01）、10.5倍（10.55±2.71 vs 1.00±0.00，P＜0.01），NF-κB基因的相對(duì)表達(dá)量降低約62%（0.38±0.07 vs 1.00±0.00，P＞0.05）。

圖3 ATO 干預(yù)后，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對(duì)表達(dá)

圖4 LPS誘導(dǎo)KLF4 過表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對(duì)表達(dá)

圖5 ATO 干預(yù)后，LPS誘導(dǎo)的Lenti-KLF4細(xì)胞IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.5 ATO干預(yù)后LPS誘導(dǎo)Lenti-KLF4細(xì)胞，巨 噬細(xì)胞表型相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果見圖5。ATO+LPS 組中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別升高約2倍（2.85±0.41 vs 1.34±0.08，P＜0.01）、3.6倍（9.84±0.96 vs 2.75±0.57，P＜0.01），NF-κB基因的相對(duì)表達(dá)量降低約55%（0.39±0.09 vs 0.87±0.02，P＜0.01）。LPS 組中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX 相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別升高約1.8倍（1.81±0.52 vs 1.00±0.00，P＜0.05）、7.5倍（7.48±0.95 vs 1.00±0.00，P＜0.05），NF-κB基因的相對(duì)表達(dá)量降低約23%（0.77±0.12 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

3 討論

單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞共同構(gòu)成機(jī)體的重要防線。巨噬細(xì)胞由單核細(xì)胞分化而來，其在機(jī)體器官內(nèi)可進(jìn)一步分化為經(jīng)典活化的M1表型（主要功能為識(shí)別、提呈、促炎）和選擇性活化的M2表型（主要功能為抑炎、修復(fù)）[11-12]，在不同免疫反應(yīng)和疾病環(huán)境下，功能相異甚至相互抑制來發(fā)揮不同的調(diào)控作用。在骨關(guān)節(jié)炎疾病中，M1和M2 型巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[13]。在非酒精性脂肪肝肝炎疾病中，調(diào)節(jié)M1 型巨噬細(xì)胞的極化可能是潛在的治療靶點(diǎn)[14]。在變態(tài)反應(yīng)性疾病中，Egawa[15]等發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞聚集并通過嗜堿性粒細(xì)胞分泌白介素4 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型偏移發(fā)揮抗炎作用，從而減輕變態(tài)反應(yīng)。同時(shí)，巨噬細(xì)胞極化對(duì)過敏性哮喘的發(fā)病具有深遠(yuǎn)影響[16]。在博萊霉素致小鼠肺纖維化中，肺內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯由M1表型向M2表型偏移且隨疾病的發(fā)生發(fā)展呈動(dòng)態(tài)變化[17]。在小鼠矽肺模型中，同樣發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞明顯由M1表型向M2表型偏移且隨疾病的發(fā)生發(fā)展呈動(dòng)態(tài)變化的現(xiàn)象[18]。

KLF4 作為一種重要的信號(hào)蛋白分子，對(duì)巨噬細(xì)胞的分化成熟具有調(diào)控作用，并成為其分化為M1 型和M2 型的標(biāo)志物[19-20]。KLF4 能夠抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4 能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞極化而作為治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的一個(gè)靶點(diǎn)[21-23]。他汀類藥物在臨床上廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)機(jī)體脂類代謝，近年來有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制心肌肥厚、改善內(nèi)皮功能等作用[24-26]。阿托伐他汀作為常用的他汀類藥物之一，在肺纖維化疾病領(lǐng)域有著廣泛的研究和應(yīng)用，其也被證實(shí)可緩解肺纖維化的進(jìn)展程度[27-28]。

本研究主要通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建體外損傷模型，以探討巨噬細(xì)胞表型偏移與他汀類藥物及KLF4的關(guān)系。我們的研究結(jié)果顯示，LPS 會(huì)抑制RAW264.7細(xì)胞內(nèi)KLF4的表達(dá)，同時(shí)阿托伐他汀會(huì)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)KLF4的表達(dá)。有研究證實(shí)，在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞中，阿托伐他汀可以有效抑制TNF-α和iNOS的mRNA表達(dá)[29]。本研究中LPS 作用于RAW264.7細(xì)胞后，可以抑制巨噬細(xì)胞由M1 型向M2 型偏移，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀干預(yù)后，LPS 作用于KLF4 過表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞表型偏移發(fā)生部分逆轉(zhuǎn)。結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)通過抑制部分博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞表型偏移而改善肺纖維化情況[32]及肺纖維化模型中KLF4 含量的動(dòng)態(tài)變化[8]，阿托伐他汀可能通過KLF4 途徑來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型偏移，進(jìn)而在肺損傷及肺纖維化病理進(jìn)程中發(fā)揮作用。本研究?jī)H通過慢病毒介導(dǎo)KLF4 過表達(dá)來探討其對(duì)巨噬細(xì)胞的表型調(diào)控，存在不足之處，還應(yīng)通過對(duì)KLF4敲低以更進(jìn)一步探討其對(duì)巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控。在機(jī)體穩(wěn)態(tài)及損傷、炎癥等不同狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞的功能異質(zhì)性不容忽視，了解阿托伐他汀的可能干預(yù)機(jī)制，可為我們進(jìn)一步探索臨床治療肺纖維化等疾病奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。