鄭程莉，竭 航，楊 營，馮達勇，唐 婕，付文龍，程建國，蔣桂梅，周 磊*

(1.四川養(yǎng)麝研究所，四川 都江堰 611845；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 南川 408435；3.陜西省動物研究所，陜西 西安 710032)

【研究意義】麝香(Moschus)是傳統(tǒng)中藥的重要成分，主要由我國一級重點保護瀕危野生藥用動物林麝(Moschusberezovskii)雄性個體分泌，麝香價格高昂，究其原因除了巨大的藥用價值和極低的產(chǎn)量外，還與圈養(yǎng)林麝有限的種群數(shù)量有關(guān)。經(jīng)過多年的人工馴養(yǎng)，林麝的群體數(shù)量仍增長緩慢。在生產(chǎn)上，繁殖力是限制麝香基原動物林麝種群數(shù)量增長的重要因素，也嚴重阻礙了麝香產(chǎn)量的提高?，F(xiàn)代的統(tǒng)計學(xué)證實了動物的產(chǎn)仔數(shù)遺傳力很低，難以通過表型選擇(外形線性評定)來改良[1]。因此，篩選出一些適當(dāng)?shù)暮蜻x基因，從分子水平上尋找調(diào)控產(chǎn)仔數(shù)的多態(tài)性，為林麝選種選育提供理論基礎(chǔ)，從而快速準備有效的提高品系選育效果?！厩叭搜芯窟M展】胰島素樣生長因子-I (Insulin-hkegrowthfactor-1,IGF-1)是一個調(diào)控動物機體生長、發(fā)育和代謝的一個重要生長因子，同時介導(dǎo)生長激素(GH)發(fā)揮生物活性，IGF-1基因?qū)游锏姆敝硻C能有一定的調(diào)控作用，主要是借助GH/IGF-1生長軸對生殖系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)[2]。秦玉梅等(2017)研究發(fā)現(xiàn)IGF-1基因與雞的產(chǎn)蛋性能存在一定的相關(guān)性，可作為雞產(chǎn)蛋性狀的分子標記[3]。Echternkamp(2004)研究發(fā)現(xiàn) IGF-1蛋白可增強卵巢的敏感性，降低優(yōu)勢卵泡的抑制性，提高雙胎率[4]。Kim.ES等(2009)等對荷斯坦奶牛研究認為IGF-1是雙胎的一個潛在的候選基因，IGF-1第二內(nèi)含子的SNP與雙胎率顯著相關(guān)[5]。M.P Mullen等(2011)研究表明IGF-1中2個SNPs位(IGFliland，IGFli2)和產(chǎn)犢時體況評分顯著相關(guān)[6]。Wang(2011)研究中國西南十幾個品種山羊發(fā)現(xiàn)，古蘭馬羊IGF-1基因微 5′側(cè)翼區(qū)多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)，AC 基因型個體產(chǎn)羔數(shù)比 AB 和 AA 高[7]。近年來研究表明，反芻動物IGF-1基因突變與產(chǎn)仔率顯著相關(guān)[8]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究旨在克隆IGF-1基因全序列，通過PCR-SSCP技術(shù)檢測IGF-1基因在林麝中的多態(tài)性，分析其與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)效應(yīng)，探討其作為分子標記可能性，【擬解決的關(guān)鍵問題】為林麝的品系選育提供理論依據(jù)，以建立林麝標記輔助選擇技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗采用林麝共36頭，其中1頭自然死亡林麝用于肝臟組織取樣，選自四川養(yǎng)麝研究所都江堰養(yǎng)麝場；35頭林麝用于毛發(fā)采集(含毛囊)，選自四川養(yǎng)麝研究所馬爾康養(yǎng)獐場。采集林麝后腿外側(cè)毛發(fā)置于封口袋中，帶回實驗室置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２檎?、收集和整理馬爾康養(yǎng)獐場35頭林麝從初產(chǎn)到現(xiàn)在的每胎產(chǎn)仔數(shù)據(jù)。

1.2 主要試劑及儀器

PCR儀(型號為TC1000-G)，臺式高速微量(冷凍型)離心機(型號為D3024R)，購自大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司；暗箱式三用紫外分析儀(型號為WFH-203B)，購自上海米青科實業(yè)有限公司；電泳儀(型號為JY300E)，垂直電泳槽(型號為JY-SC26+)，水平電泳槽(型號為JY-SPAT)，凝膠成像分析系統(tǒng)(型號為JY04S-3E)，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 主要試劑

一管式毛發(fā)DNA抽提試劑盒，Master Mix酶， Marker DL2000，核酸燃料，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他藥品(瓊脂糖、Tris、EDTA、硼酸等)為國內(nèi)分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 基因組DNA的提取 取20～30根帶毛囊的毛發(fā)，取其根部，放入1.5 mL離心管中，加入30 μl Qlysis-H Reagent和1 μl Proteinase K，震蕩，56 ℃水浴30 min，100 ℃水浴8 min； 12 000 r/min離心3 min，上清液用于PCR反應(yīng)；用1 %的瓊脂糖凝膠檢測DNA；根據(jù)所測定的值和所需要的DNA的濃度來確DNA的稀釋倍數(shù)；然后儲存在-20 ℃的冰箱中備用。

1.4.2 引物的設(shè)計與合成 研究參照GenBank上提交的牛IGF-1基因序列(登錄號：X15726.1)，通過引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0 和Oligo7設(shè)計林麝IGF-1基因的克隆引物和SSCP引物，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

1.4.3 PCR擴增與測序IGF-1基因PCR反應(yīng)體系(20 μl)： 2×Master PCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O：6 μl。IGF-1基因PCR反應(yīng)條件如下表2。

1.4.4 生物信息學(xué)分析 將克隆測序結(jié)果用DNAStar、ExPASy-ProtParam tool、ExPASy-ProScale、NetPhos 2.0、SignalP4.0 Server、PSORT、PBIL-IBCP Lyon-Gerland、motif Scan等軟件對所得序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增

用肝臟組織提取出的cDNA為模板，經(jīng)PCR后取4 μl產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，Marker 為DL2000，用引物P1經(jīng)PCR擴增獲得大小為465 bp的IGF-1基因，如圖1中IGF1-(2)所示條帶。

2.2 生物信息分析

2.2.1 基本理化性質(zhì)分析 根據(jù)測序得知，林麝IGF-1基因cDNA序列全長為465 bp，其中包含1個462 bp的完整的開放閱讀框(ORF)；這個開放閱讀框包含153個氨基酸殘基，包含了1個起始密碼子GGA和1個終止密碼子TAG，預(yù)測的分子量大小為17.05 kDa，分子式為C743H1184N214O216S15，等電點為9.40。根據(jù)在線軟件ExPASy-ProtParam預(yù)測結(jié)果顯示，帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為11個，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為22個，這表示這個蛋白可能帶正電荷。這個序列不包含任何Trp殘基，N端的殘基為Met。這個蛋白在體外的活性時間大概為30 h。經(jīng)過軟件計算，這個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為55.76，這表明這個蛋白在理化性質(zhì)上是不穩(wěn)定的。脂肪指數(shù)為64.68，親水性為-0.251，這提示此蛋白親水性差，脂溶性強。

表1 IGH-1基因的PCR擴增的引物序列Table 1 Sequences of primers used in PCR amplification of IGH-1

表2 IGF-1基因引物PCR擴增程序Table 2 PCR programs for two primer pairs of IGF-1 gene

2.2.2 IGF-1蛋白磷酸化位點預(yù)測 由圖2所示，用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測林麝IGF-1氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)有15個磷酸化位點，分別是9個Ser磷酸化位點、4個Thr磷酸化位點和2個Tyr磷酸化位點。

圖1 IGF-1基因PCR擴增圖Fig.1 PCR amplified figure of IGF-1 gene

2.2.3 IGF-1蛋白信號肽分析 如圖3所示，利用ExPASy的SignalP-4.0程序預(yù)測林麝IGF-1蛋白是否含有信號肽。林麝IGF-1蛋白是一個分泌性蛋白，預(yù)測的肽段切割位點在第49和50位氨基酸之間。利用在線TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/)分析發(fā)現(xiàn) IGF-1不是跨膜蛋白。通過PSORT(http://psort.hgc.jp/)對IGF-1蛋白進行定位，發(fā)現(xiàn)65.2 %存在于細胞核中，17.4 %存在于線粒體中，4.3 %存在于囊泡分泌系統(tǒng)中，4.3 %存在于細胞質(zhì)中，4.3 %存在于細胞外(包括細胞壁)， 4.3 %存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.2.4 IGF-1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 由圖4所示，通過PBIL-IBCP Lyon-Gerland中的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件NPS@中的GOR對IGF-1氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示：預(yù)測氨基酸序列中包含α-螺旋：23.38 %；無規(guī)卷曲：70.13 %；延伸片斷：6.49 %。

圖2 IGF-1蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.2 Pediction of phosphorylation sites of IGF-1 protein

S為信號肽預(yù)測參考值；C是斷裂點預(yù)測；Y為兩者的校正斷裂點綜合值圖3 IGF-1蛋白的信號肽預(yù)測Fig.3 Signal peptide prediction of IGF-1 protein

圖4 IGF-1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of IGF-1 protein

2.2.5 IGF-1保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測 由圖5可以看出，通過motif Scan工具(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)，對IGF-1氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)就只有一個保守結(jié)構(gòu)域，IGF-1氨基酸序列52～110位為Insulin(Insulin/IGF/Relaxin)家族典型的保守結(jié)構(gòu)功能域。

2.3 PCR-SSCP結(jié)果檢測分析

2.3.1IGF-1基因的PCR-SSCP結(jié)果檢測 由圖6所示，對于IGF-1基因SSCP引物的PCR擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的片段與預(yù)期大小相一致，沒有非特異性擴增條帶，但是引物2條帶不清晰，其余6條引物可直接進行SSCP分析。

圖5 IGF-1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Prediction of conserved structure domain of IGF-1 protein

1～7PCR擴增產(chǎn)物；M：DL2000標準分子量圖6 林麝IGF-1 基因PCR產(chǎn)物(1 %)Fig.6 PCR product of IGF-1 in Moschus berezovskii(1 %)

圖7 林麝IGF-1 擴增片段的SSCP分析Fig.7 SSCP analysis of PCR amplification of IGF-1 in Moschus berezovskii

由圖7所示，對引物擴增的PCR產(chǎn)物進行SSCP分析，引物擴增片段用10 %的聚丙烯酰胺凝膠進行檢測，發(fā)現(xiàn)擴增片段沒有特異性條帶。

2.3.2IGF-1基因引物的測序結(jié)果 為證明SSCP擴增結(jié)果，選擇引物6進行擴增，得到35個毛發(fā)樣品的PCR產(chǎn)物，并對其產(chǎn)物進行測序，發(fā)現(xiàn)6個PCR產(chǎn)物的序列完全一致，沒有多態(tài)性(圖8)。

3 小 結(jié)

IGF-1作為IGFs家族的重要成員，在促進蛋白質(zhì)合成、細胞生長和分化、胚胎發(fā)育及代謝調(diào)控等方面都發(fā)揮著重要的生理作用[9]。目前，國內(nèi)外對IGF-1受體的相關(guān)研究已大量開展，但對于林麝這種高原動物IGF-1基因相關(guān)基礎(chǔ)研究尚屬空白。林麝種群數(shù)量的緩慢增長嚴重制約了其產(chǎn)物麝香產(chǎn)量的提高。IGF-1基因突變與產(chǎn)仔率顯著相關(guān)，研究林麝IGF-1分子結(jié)構(gòu)和功能特點，分析其序列中多態(tài)位點，對建立林麝標記輔助選擇技術(shù)體系具有重要意義。

圖8 林麝IGF-1基因序列比較Fig.8 Sequence comparison of IGF-1 gene in Moschus berezovskii

4 討 論

4.1 結(jié)構(gòu)與功能

本研究利用生物學(xué)相關(guān)軟件對得到的序列進行分析和預(yù)測，其中IGF-1蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示，在153個氨基酸殘基中，IGF-1蛋白擁有15個磷酸化位點，但以絲氨酸為主，說明高含量的磷酸化位點能夠增加該蛋白的活力。

進一步研究發(fā)現(xiàn)林麝IGF-1蛋白是一個分泌性蛋白，并且擁有Insulin家族典型的保守結(jié)構(gòu)功能域，預(yù)測的肽段切割位點在第49和50位氨基酸之間，主要存在于細胞核中，提示IGF-1作為胞內(nèi)核受體，通過增加蛋白活力，以引起其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進而作用于一系列信號通路，導(dǎo)致細胞核發(fā)生生理生化反應(yīng)。有研究提示IGF-1蛋白的遺傳變異與生物性狀的變化有密切關(guān)系[10]。

4.2 多態(tài)性分析

本試驗設(shè)計的IGF-1基因的PCR-SSCP擴增片段長度均為300 bp左右，引物擴增片段用10 %的聚丙烯酰胺凝膠進行檢測，發(fā)現(xiàn)擴增片段沒有特異性條帶。為證明PCR-SSCP擴增結(jié)果，選擇其中一條引物對所得的毛發(fā)樣品進行擴增，測序發(fā)現(xiàn)所有PCR產(chǎn)物的序列完全一致，沒有多態(tài)性。研究表明不能選擇IGF-1基因作為林麝的分子遺傳標記。

本研究的材料取自四川養(yǎng)麝研究所馬爾康養(yǎng)獐場。為響應(yīng)國務(wù)院“變野生動植物為家養(yǎng)家種”的政策方針，該場于1958年建立，在建立之初，從野外逮捕林麝進行科學(xué)研究，在養(yǎng)殖到一定時期，停止從野外抓捕林麝進行馴養(yǎng)。據(jù)統(tǒng)計，在1992年，場內(nèi)養(yǎng)殖林麝數(shù)量僅為142頭，并在此基礎(chǔ)上進行長達20多年的封閉繁育狀態(tài)，導(dǎo)致其遺傳漂變?nèi)笔А?/p>

因此，在對林麝毛發(fā)進行多態(tài)性檢測時，未能檢測出IGF-1基因的多態(tài)位點，究其原因，應(yīng)該與群體內(nèi)部近親繁殖有密切關(guān)系。雖未能檢出IGF-1基因的多態(tài)位點，不能對其產(chǎn)仔性能進行標記選育，但是為林麝產(chǎn)香性能的分子遺傳標記選育提供了基本思路。