劉秋華 謝梅鳳 王廷芹

摘要：以粉紅色金魚草花瓣為原料，采用溶劑萃取法提取金魚草花色素。用1 g ∶ 50 mL的料液比，選取提取劑、提取時間、提取溫度、pH值等為萃取因素進(jìn)行單因素試驗，用4因素3水平正交表[L9（34）]進(jìn)行正交試驗優(yōu)化試驗，確定最佳的萃取條件。采用最佳的萃取條件提取金魚草花色素，分析金魚草花色素的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，金魚草花色素的最佳萃取條件：以20%乙醇為萃取劑，提取溫度為40 ℃，提取時間為30 min，pH值為7。金魚草花色素具有一定的耐光性;不耐強酸，可在中性或堿性環(huán)境中保存;容易被氧化，耐還原性差;K+增色效果明顯，但K+、Al3+、Cu2+、Fe3+會改變色素的顏色;食品添加劑對金魚草花色素沒有明顯的影響。

關(guān)鍵詞：金魚草;花色素;提取工藝;穩(wěn)定性;正交試驗

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0235-05

金魚草（Antirrhinum majus L.），別稱龍頭花、獅子草、龍口花、洋彩雀等，玄參科金魚草屬，多年生草本植物。全草均可入藥，具有清涼虛熱、解除毒素、活通血液、消除腫痛等功能[1-2]。由于其花期長，花色豐富艷麗，是園林綠化和切花常用的草本花卉，也是研究分子生物學(xué)和遺傳學(xué)，特別是花器官形成、轉(zhuǎn)座子等方面的重要模式植物。金魚草花色素作為一種天然色素，在食品、日化用品、保健品和紡織品等應(yīng)用領(lǐng)域極具開發(fā)前景。

目前，國內(nèi)外對金魚草的研究主要集中在基因克隆及表達(dá)分析[3-8]、組織培養(yǎng)[9-13]、花香[14-15]、生長調(diào)控[16-18]、切花生產(chǎn)[19-22]等方面，對金魚草花色素的研究尚少。本研究對金魚草花色素的提取工藝進(jìn)行研究，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期建立高效的金魚草花色素提取工藝，為金魚草花色素的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017年9月采購云南斗南花卉市場的粉紅色金魚草切花，于廣東海洋大學(xué)興農(nóng)樓318室進(jìn)行干燥處理。

所用試劑有無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、六水氯化鎂、九水硝酸鋁、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、二水氯化鈣、五水硫酸銅、六水氯化鐵、亞硫酸氫鈉、過氧化氫、蔗糖、可溶性淀粉等，均為分析純，購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;食鹽，購自廣東省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品;咖啡研磨機，浙江永康鉑歐五金制品有限公司產(chǎn)品;AY120電子天平，日本島津公司產(chǎn)品;7200可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品;電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品;離心機，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料處理 將新鮮的金魚草花瓣，去除花柄、花蕊，洗干凈花瓣上的花粉、灰塵等雜質(zhì)，放入烘箱烘干直至恒質(zhì)量。再用咖啡研磨機將干燥好的花瓣研磨成粉末[23]，過60目篩，備用。

1.3.2 金魚草花色素的光譜特征 稱取0.20 g花瓣粉末于試管中，用蒸餾水定容至10 mL，振蕩，室溫下浸泡提取 30 min，過濾得濾液，即金魚草花色素提取液。以蒸餾水為參比液，室溫下用分光光度計在320～400 nm波長內(nèi)測定其吸光度，確定最大吸收波長。

1.3.3 金魚草花色素提取的單因素試驗

1.3.3.1 提取劑的選擇 稱取0.20 g花瓣粉末于試管中，分別以蒸餾水、10%乙醇、20%乙醇、10%丙酮、1% HCl、1%檸檬酸作為提取劑[24]，定容至10 mL，振蕩，室溫下浸泡提取30 min，過濾得濾液，用提取劑作為參比液，并用7200可見分光光度計在最大吸光波長處，測定不同上清液的吸光度（D），篩選出最佳的提取劑。

1.3.3.2 提取時間的選擇 稱取0.20 g花瓣粉末于試管中，用已選定的最佳提取劑，定容至10 mL，振蕩，分別在室溫下浸泡提取15、30、45、60、75、90 min，過濾得濾液，用提取劑作參比液，并用7200可見分光光度計在最大吸光波長處，測定不同上清液的D，篩選出最佳的提取時間。

1.3.3.3 提取溫度的選擇 稱取0.20 g花瓣粉末于試管中，用已選定的最佳提取劑，定容至10 mL，振蕩，分別在21（室溫）、30、40、50、60、70 ℃浸泡提取，提取時間為“1.3.3.2節(jié)”中確定的最佳提取時間，過濾得濾液，用提取劑作參比液，并用7200可見分光光度計在最大吸光波長處，測定不同上清液的D，篩選出最適的提取溫度。

1.3.3.4 提取劑pH值的選擇 將上面得到的最佳提取劑用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaCl分別調(diào)節(jié)pH值至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。稱取0.20 g花瓣粉末于試管中，分別加入已調(diào)好pH值的提取劑，定容至10 mL，振蕩，在最適的提取溫度下浸泡提取至最佳提取時間，過濾得濾液，用提取劑作參比液，并用7200可見分光光度計在最大吸光波長處，測定不同上清液的D，篩選出最佳的提取劑pH值。

1.3.4 金魚草花色素提取的正交試驗 考慮到各提取條件之間可能存在交互作用，會影響對金魚草花色素的提取效果。綜合上述試驗結(jié)果，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計一個4因素3水平L9（34）的正交試驗，驗證單因素試驗的效果，確定金魚草花色素的最佳提取條件。用提取劑作參比液，并用7200可見分光光度計在最大吸光波長處，測定不同上清液的D。正交試驗設(shè)計如表1所示。

1.3.5 金魚草花色素穩(wěn)定性分析 用上述最佳提取條件提取金魚草花色素溶液，備用。

金魚草花色素的耐光性：取2份色素溶液，一份放置室內(nèi)自然光下，一份放置黑暗條件下。在最大吸收波長處，每天測定其吸光度。

金魚草花色素的耐酸堿性：取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量不同pH值（1～11）20%乙醇溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置2 h，在最大吸收波長處測定吸光度。

金魚草花色素的耐還原性：取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L的NaHSO3溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置1 h，在最大吸收波長處測定吸光度。

金魚草花色素的耐氧化性：取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量濃度為0%、5%、10%、15%、20%、25%的H2O2溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置1 h，在最大吸收波長處測定吸光度。

各種金屬離子對金魚草花色素穩(wěn)定性的影響：取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量的蒸餾水及濃度為 0.1 mol/L含Na+、K+、Mg2+、Al3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+的溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置1 h，觀察其顏色變化，在最大吸收波長處測定吸光度。

常見食品添加劑對金魚草花色素穩(wěn)定性的影響：取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量濃度為0、5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置 1 h，在最大吸收波長處測定吸光度;取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量濃度為0、2、4、6、8、10、12 g/L食鹽溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置1 h，在最大吸收波長處測定吸光度;取色素溶液2 mL于試管中，分別加入等量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L可溶性淀粉溶液，振蕩使其充分混合均勻，室溫下放置1 h，在最大吸收波長處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，試驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件中的LSD法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金魚草花色素的光譜特征

由圖1可知，在波長為320～340 nm時，隨著波長的增加，金魚草花色素的吸光度上升，并在340 nm時達(dá)到最大值。而隨著波長再增加，吸光度不斷下降。由此判斷，金魚草花色素的最大吸收波長為340 nm。

2.2 金魚草花色素的提取

2.2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1.1 最佳提取劑的選擇 從圖2可知，以10%乙醇、20%乙醇和10%丙酮為提取溶劑時，提取液的吸光度較大，其中20%乙醇提取液的吸光度最大;蒸餾水為提取溶劑時，提取液的吸光度次之;1%的 HCl和檸檬酸提取液的吸光度較小，提取效果較差。綜合考慮，采用20%乙醇作為金魚草花色素的提取劑。

2.2.1.2 最佳提取時間的選擇 從圖3可知，隨著提取時間的延長，提取液的吸光度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)提取時間為30 min時達(dá)到最大值，為0.753 9。當(dāng)提取時間超過 45 min，提取溶液的吸光度逐漸降低，可能由于提取時間過長導(dǎo)致色素破壞。因此，選擇30 min作為金魚草花色素的最佳提取時間。

2.2.1.3 最佳提取溫度的選擇 從圖4可知，隨著提取溫度的升高，金魚草花提取液的吸光度隨溫度的升高而逐漸增大，并在40 ℃時達(dá)到峰值。當(dāng)提取溫度超過40 ℃時，金魚草花提取液吸光度隨溫度的升高而減小。這說明隨著提取溫度的升高，可以加速金魚草花色素溶解到提取液中，而溫度超過40 ℃，可能會破壞色素的結(jié)構(gòu)，色素發(fā)生分解。因此，選擇 40 ℃ 作為金魚草花色素的最佳提取溫度。

2.2.1.4 最佳pH值的選擇 從圖5可知，在pH值為1～7

時，隨著pH值的增大，金魚草花色素的吸光度逐漸上升，并在pH值為7時達(dá)到峰值，為0.875 3，而隨著pH值的進(jìn)一步增大，吸光度下降。因此，選擇pH值為7作為金魚草花色素提取的最佳提取pH值。

2.2.2 正交試驗分析結(jié)果 由表2可知，金魚草花色素各提取條件的影響因素表現(xiàn)為乙醇濃度>提取溫度>提取時間>pH值，最佳提取工藝組合為A3B1C3D3，即pH值為8，提取劑為20%乙醇，提取溫度為50 ℃，提取時間為15 min。

2.3 金魚草色素的穩(wěn)定性分析

2.3.1 金魚草花色素的耐光性 由圖6可知，金魚草花色素在光照環(huán)境下和黑暗條件下的吸光度變化趨勢一致，說明金魚草花色素具有一定的耐光性。2種環(huán)境下，金魚草色素的吸光度從第1天到第3天不斷下降，在第4天吸光度急速上升，第4天到第7天緩慢上升。可見隨著時間的推移，金魚草花色素穩(wěn)定性降低，會產(chǎn)生其他物質(zhì)。

2.3.2 金魚草花色素的耐酸堿性 從圖7可知，pH值在 1～3之間，金魚草花色素的吸光度不斷上升，pH值≥4時，金魚草花色素的吸光度基本一致，沒有明顯波動。pH值為4～10這7個處理之間沒有明顯差異，pH值為3～11這9個處理的吸光度明顯大于pH值為1、2時地吸光度。說明金魚草花色素在 pH<3的強酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，在中性和堿性環(huán)境下能穩(wěn)定保存。

2.3.3 金魚草花色素的耐還原性 從圖8可以看出，加入不同濃度NaHSO3的各處理的金魚草花色素的吸光度均大于空白對照組。除0.20 mol/L NaHSO3處理外，不同濃度NaHSO3的各個處理與對照組之間都具有明顯差異。加入NaHSO3后，所有金魚草花色素的顏色均變成黃色。說明金魚草花色素耐還原性差。

2.3.4 金魚草花色素的耐氧化性 從圖9可知，隨著H2O2處理濃度的升高，金魚草花色素的吸光度逐漸下降，說明金魚

草花色素容易被H2O2氧化，金魚草色素的耐氧化性不強。

2.3.5 各種金屬離子對金魚草花色素穩(wěn)定性的影響 從圖10可以看出，Na+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+對金魚草花色素吸光度基本無影響。而K+、Cu2+、Fe3+、Al3+對金魚草花色素吸光度有明顯影響，表明金魚草花色素在Na+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+條件下穩(wěn)定，在K+、Cu2+、Fe3+、Al3+條件下不穩(wěn)定。加入K+后，溶液顏色由紅棕色變成深棕色，加入Al3+后，溶液顏色由紅棕色變成橙黃色，加入Cu2+后，溶液顏色由紅棕色變成黃色，加入Fe3+后，溶液顏色由紅棕色變成深褐色。因此金魚草花色素加工和包裝材料應(yīng)避免接觸鋁、銅、鐵。

2.3.6 常見食品添加劑對金魚草花色素穩(wěn)定性的影響 由圖11可以看出，除加入30 g/L蔗糖后金魚草花色素的吸光度與對照組有明顯差異外，其他處理均與對照組之間沒有明顯差異;食鹽、可溶性淀粉對金魚草花色素的穩(wěn)定性均無明顯影響，可與金魚草花色素混合使用。

3 討論

天然色素與合成色素相比，具有較強的生理活性、來源廣、對人體安全性高等特點。隨著生活水平不斷提高，人們的健康意識逐步增強，對天然色素產(chǎn)品的需求日益增加。天然色素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品添加劑、紡織品等應(yīng)用領(lǐng)域[25-27]。金魚草作為園林花卉在我國廣為栽種，其花色豐富，可成為天然色素新來源。

國內(nèi)外花色素的提取分離多采用有溶劑萃取法、超聲波法、多級溶劑萃取法、吸附層析法[28-30]等。本研究將花瓣烘干后磨成粉末，采用溶劑萃取法，確定金魚草花色素最佳提取條件：以20%乙醇為提取劑，提取溫度為40 ℃，提取時間為 30 min，提取pH值為7。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，金魚草花色

素具有一定的耐光性;不耐強酸，可在中性或堿性環(huán)境中保存;容易被氧化，耐還原性差;Na+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+對金魚草花色素穩(wěn)定性沒有明顯影響，K+增色效果明顯，K+、Al3+、Cu2+、Fe3+會與金魚草花色素發(fā)生顏色反應(yīng);食品添加劑蔗糖、食鹽、可溶性淀粉對金魚草花色素穩(wěn)定性影響不明顯。作為天然花色素，金魚草花色素具有較大的應(yīng)用前景，在食品、日化用品、紡織品和醫(yī)療保健品等中使用前，須要做進(jìn)一步研究分析其毒性作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李竹英，錢艷紅，毛紹春. 不同激素對金魚草莖尖組織培養(yǎng)效果初探[J]. 北方園藝，2006（3）：130-131.

[2]張喜艷，鄭思鄉(xiāng). 不同倍性金魚草形態(tài)學(xué)與染色體觀察[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，24（2）：316-318.

[3]付宇辰，劉曉慧，冷平生，等. 金魚草12-氧-植物二烯酸還原酶基因AmOPR的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國觀賞園藝研究進(jìn)展，2018，2018：504-510.

[4]王少杰，劉曉慧，胡增輝，等. 金魚草脂氧合酶基因AmLOX1的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2018，40（6）：905-912.

[5]曹舸洋. 調(diào)節(jié)金魚草葉序發(fā)育AmPIN1a基因克隆和轉(zhuǎn)基因分析[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[6]Naing A H，Park K I，Ai T N，et al.Overexpression of snapdragon Delila （Del） gene in tobacco enhances anthocyanin accumulation and abiotic stress tolerance[J]. BMC Plant Biology，2017，17（1）：65-79.

[7]劉曉慧，冷平生，胡增輝. 金魚草丙二烯環(huán)化酶基因AmAOC的克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，2017，15（9）：3489-3496.

[8]燕一波，郭玉雙. 金魚草花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及表達(dá)特性分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，2017，38（6）：1101-1105.

[9]李兆婷. 金魚草養(yǎng)分吸收積累規(guī)律及遺傳轉(zhuǎn)化體系初探[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2016.

[10]李丹丹，夏 淋，王國偉，等. 激素對金魚草莖尖快繁及對后期葉序形成的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，40（5）：871-874.

[11]李成慧，唐 蓉，朱廣慧，等. 金魚草組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 金陵科技學(xué)院學(xué)報，2013，29（2）：76-78.

[12]李竹英，錢艷紅，毛紹春. 不同激素對金魚草莖尖組織培養(yǎng)效果初探[J]. 北方園藝，2006（3）：130-131.

[13]谷 旭，劉 洋，高迎秋，等. 金魚草嫩莖組織培養(yǎng)及無性系建立的研究[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，39（5）：569-572.

[14]趙 靜，胡增輝，冷平生，等. 兩個金魚草品種香氣成分分析[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2013，28（3）：24-28.

[15]Dudareva N，Nurfitt L.M，Mann CJ，et al.Developent regulation of methyl benzoate biosynthesis and emission in snapdragon flowers[J]. The Plant Cell，2000（12）：949-961.

[16]孫麗萍，衣彩潔，溫永剛. 3種生長調(diào)節(jié)劑對金魚草穴盤苗生長調(diào)控作用[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2017，32（1）：64-68.

[17]翟玉瑩，李 新，梅發(fā)博，等. GA3和6-BA對金魚草生長及生理特性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（28）：60-62.

[18]劉紫微，蔣亞蓉，雷 蕾，等. 消毒時間、光照和溫度對金魚草種子萌發(fā)的影響[J]. 北方園藝，2015（18）：88-91.

[19]朱廣慧，唐 蓉，鄧 波，等. 不同品種切花金魚草對低溫脅迫的生理響應(yīng)及抗寒性分析[J]. 北方園藝，2013（23）：100-102.

[20]張瑜瑜，李 晶，吳 旭，等. 金魚草切花瓶插生理和保鮮效應(yīng)研究[J]. 北方園藝，2013（9）：154-159.

[21]孫正海，辛培堯，林開文，等. 中藥材浸提液對金魚草切花瓶插壽命的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：225-228.

[22]高 瓊，呂炯璋. STS預(yù)處理對切花金魚草瓶插生理的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，31（1）：53-56.

[23]楊佩斯，董 樂，葉字海. 紅龍草色素的提取工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：97-100.

[24]趙珍珍. 紅肉火龍果色素提取工藝優(yōu)化及其化學(xué)成份分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[25]黃韜睿，王 鑫，孟 甜. 天然色素替代亞硝酸鹽在臘肉著色和護(hù)色中的應(yīng)用研究[J]. 食品科技，2019，44（2）：134-137.

[26]劉海靈，劉 媛，王香鳳. 天然紫草素在紡織印染領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J]. 針織工業(yè)，2018（10）：41-44.

[27]舒冠雄，賈 佳，孫 虎，等. 天然色素的應(yīng)用及發(fā)展[J]. 中國食品工業(yè)，2017（4）：64-66.

[28]昝立峰，王更先，葉 嘉，等. 黃刺玫花色素的提取工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（22）：221-224.

[29]徐 飛，鈕福祥，孫 建，等. 冷凍對甘薯紫色花青素提取的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（24）：214-216.

[30]房照龍，扈本荃. 現(xiàn)代提取技術(shù)在天然色素領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 廣州化工，2018，46（8）：21-23.

收稿日期：2019-09-27

基金項目：廣東新安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥品生物技術(shù)特色專業(yè)建設(shè)項目（編號：2017YJZJ003）。

作者簡介：劉秋華（1978—），女，山東兗州人，博士，講師，主要從事食品、藥品生物技術(shù)領(lǐng)域的研究。E-mail：lqhnj@163.com。

通信作者：王廷芹，博士，副教授，主要從事園藝栽培生理研究。E-mail：wtqin@163.com。