張培哲，曹邦明，李佳俊，張弛，夏明，楊向軍

長(zhǎng)期以來維生素K拮抗劑如華法林長(zhǎng)期應(yīng)用于口服抗凝治療，但其治療窗窄、受食物藥物影響大、需定期檢測(cè)及調(diào)整藥物劑量、高出血風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)和不足而限制臨床應(yīng)用[1]，甚至在治療窗內(nèi)仍有高達(dá)6%的嚴(yán)重出血事件發(fā)生[2]。近來新型口服抗凝藥物克服以上不足成為抗凝治療新選擇，其中達(dá)比加群為合成的非肽類小分子、可逆性、特異性直接凝血酶抑制劑，能抑制游離型和與纖維蛋白單體結(jié)合的凝血酶的活性[3]，因此比華法林和低分子肝素更好的發(fā)揮抗凝效果。其前體藥物達(dá)比加群酯無生物學(xué)活性，口服后經(jīng)CES1和CES2兩種酯酶水解后可迅速轉(zhuǎn)化為有抗凝活性的達(dá)比加群[4]。RE-LY研究表明兩種劑量的達(dá)比加群酯兩天2次口服抗凝效果不劣于華法林且安全性更高，使更多的國(guó)家批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的抗凝治療[5]。目前達(dá)比加群的具體治療窗尚未界定，且不良事件的發(fā)生與血藥谷濃度相關(guān)[6]，比華法林有更高的胃腸道出血風(fēng)險(xiǎn)[2]，亦有其出血致死性事件的報(bào)道[7]，故仍需觀察達(dá)比加群的藥理學(xué)特性及通過實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果評(píng)估其抗凝作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥品和試劑 達(dá)比加群酯膠囊150 mg(商品名為泰畢全，批號(hào)507056)購(gòu)自勃林格殷格翰公司(德國(guó))，部分凝血酶原時(shí)間(APTT)試劑(批號(hào)114873RE)、凝血酶時(shí)間(TT)試劑(批號(hào)114393)、STA-ECA主試劑(批號(hào)114814RE)及相關(guān)定標(biāo)品(批號(hào)114288)和質(zhì)控品(批號(hào)114289)均購(gòu)自stago公司(法國(guó))，達(dá)比加群(批號(hào)1-JYS-153-1)和達(dá)比加群-d3(批號(hào)2-NOT-148-1)均購(gòu)自TRC公司(加拿大)，羧甲基纖維素鈉，二甲基亞砜(DMSO)，乙酸銨、甲酸、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

1.1.2主要儀器 API 4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；STA Compact System全自動(dòng)血凝儀(法國(guó)stago公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 18只雄性新西蘭大白兔，普通級(jí)，體質(zhì)量2.3～3.0 kg，均購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SYXK(蘇)2012-0062)，實(shí)驗(yàn)前均常規(guī)飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。本研究中對(duì)于大白兔的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2溶液配制 達(dá)比加群酯溶于0.4% DMSO和0.5% 羧甲基纖維素鈉配制成懸浮液，每次實(shí)驗(yàn)前晚配制，4 ℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。其他試劑配制參考各自說明書。

1.2.3實(shí)驗(yàn)過程及標(biāo)本處理 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、5 mg/kg組和10 mg/kg組，每組6只。5 mg/kg組和10 mg/kg組分別灌胃5 mg/kg和10 mg/kg的達(dá)比加群酯溶液，對(duì)照組灌胃等體積的溶劑，分別于給藥前、給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h通過兔耳中央動(dòng)脈采血2.7 mL，置于3.2%枸櫞酸鈉抗凝管中(1∶9)混勻后1 500×g離心20 min后取血漿分裝立即凍存于-70 ℃直至檢測(cè)。LC-MS/MS檢測(cè)前室溫溶解，其他實(shí)驗(yàn)室檢查檢測(cè)前均37 ℃孵育15 min。

1.2.4藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 采用LC-MS/MS法檢測(cè)達(dá)比加群藥物濃度，最小檢測(cè)濃度1 ng/mL。達(dá)比加群標(biāo)準(zhǔn)品用空白兔血漿配制成濃度范圍為0～5 000 ng/mL的定標(biāo)品，達(dá)比加群-d3(內(nèi)標(biāo)品)配制成100 ng/mL的溶液，檢測(cè)過程參考Stangier等[8]方法并適量修改。取50 μL待檢測(cè)標(biāo)本或定標(biāo)品加入50 μL內(nèi)標(biāo)物混勻后再加入20 μL的0.2 N NaOH 37 ℃孵育2 h，然后加入30 μL的0.2 N HCl和200 μL的甲醇充分混勻2 min后13 000×g離心10 min，取10 μL上清進(jìn)行LC-MS/MS上機(jī)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱Venusil MP C18(2.1 mm×150 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相A液(5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸溶液)和流動(dòng)相B液(乙腈-0.1%甲酸溶液)梯度洗脫：0～1 min，5% 流動(dòng)B液；0～1 min，5% 流動(dòng)B液；1～1.5 min，95% 流動(dòng)B液；1.5～3.5 min，95% 流動(dòng)B液；3.5～3.6 min，5% 流動(dòng)B液，流速0.3 mL/min。質(zhì)譜分析采用電噴霧離子化源正離子和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描，用于定量分析的離子對(duì)分別為達(dá)比加群m/z 472.0→289.0和達(dá)比加群-d3 m/z 475.6→292.2，總體分析時(shí)間5 min。

表1 各實(shí)驗(yàn)組的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1.2.5實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果檢測(cè) 采用STA Compact System全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)APTT、TT及達(dá)比加群濃度[蛇靜脈酶發(fā)色底物法(ECA)]，具體步驟參照各自說明書，每次檢測(cè)前均做定標(biāo)和質(zhì)控。

2 結(jié)果

2.1藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果兩實(shí)驗(yàn)組主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1，平均藥物濃度-時(shí)間曲線見圖1。

圖1 平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.2各組TT比值隨時(shí)間變化曲線與對(duì)照組相比，給藥后TT-時(shí)間曲線隨藥-時(shí)曲線有類似的變化，提示達(dá)比加群在體內(nèi)抗凝效果無時(shí)間延遲(圖2)。

圖2 TT隨時(shí)間變化曲線

2.3實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與LC-MS/MS相關(guān)性分析相關(guān)性分析提示APTT與LC-MS/MS檢測(cè)的血藥濃度呈低度相關(guān)(R2=0.224，圖3)且高濃度時(shí)易超出儀器檢測(cè)上限；TT與LC-MS/MS檢測(cè)血藥濃度呈高度相關(guān)(R2=0.780，圖4)，低濃度時(shí)即顯著延長(zhǎng)；ECA檢查結(jié)果與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析提示兩者呈高度相關(guān)(R2=0.882，圖5)，但高濃度時(shí)(LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果>300 ng/mL)無法得出ECA結(jié)果，Bland-Altman偏倚性分析圖顯示絕大多數(shù)ECA檢查結(jié)果低于LC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果(圖6)。

圖3 APTT與LC-MS/MS對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖

圖4 TT與LC-MS/MS對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖

圖5 ECA與LC-MS/MS對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖

圖6 Bland-Altman偏倚性分析圖

3 討論

達(dá)比加群為新型小分子非肽類可逆性直接凝血酶抑制劑，其藥理學(xué)特征是可預(yù)測(cè)和可重復(fù)的，很少受食物藥物影響且治療窗廣，無需常規(guī)監(jiān)測(cè)藥物濃度，但在臨床中出現(xiàn)一些特殊情況如懷疑藥物過量、急診手術(shù)、致死性大出血等情況時(shí)，有效的實(shí)驗(yàn)室檢查檢測(cè)其抗凝效果仍十分必要[1，9]。而RE-LY研究表明口服達(dá)比加群酯的不良事件的發(fā)生與血藥谷濃度相關(guān)[6，10]，故檢測(cè)藥物谷濃度可一定程度的避免不良事件的發(fā)生。

Stangier等[11]和Blech等[12]均指出與葡糖醛酸結(jié)合(結(jié)合型)的達(dá)比加群和游離型的達(dá)比加群有同樣的藥理學(xué)活性，也有研究指出對(duì)比游離型的達(dá)比加群，結(jié)合型的達(dá)比加群對(duì)APTT有類似的延長(zhǎng)作用[13]，同時(shí)Stangier[14]亦指出達(dá)比加群的葡萄苷酸化并不影響其臨床療效，因此總體達(dá)比加群濃度可能更精確的反應(yīng)體內(nèi)的抗凝效果。本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS檢測(cè)總達(dá)比加群的血藥濃度，結(jié)果表明達(dá)比加群在新西蘭大白兔中的藥代動(dòng)力學(xué)特性與其他動(dòng)物和人相似[14-15]，提示達(dá)比加群在不同物種間有相似的藥代動(dòng)力學(xué)且是可預(yù)測(cè)的，這也為在新西蘭大白兔模型中研究達(dá)比加群抗凝效果提供一定的理論依據(jù)。同時(shí)各組TT-時(shí)間曲線顯示出與藥-時(shí)曲線類似的趨勢(shì)，提示達(dá)比加群的抗凝效果無時(shí)間延遲，這也與其他研究結(jié)果一致[11]。雖然LC-MS/MS為藥物檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)[16]，但其儀器設(shè)備昂貴，操作及維修保養(yǎng)要求高，很難在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室普及[1]，故本研究同時(shí)采用ECA檢測(cè)達(dá)比加群的血漿藥物濃度[17]并探討兩者檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。研究表明ECA檢測(cè)不受待檢測(cè)血樣中凝血酶原和纖維蛋白原含量的影響，利用ECA檢測(cè)達(dá)比加群的血漿藥物濃度可有效的排除凝血因子缺乏時(shí)的影響[18]。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析顯示LC-MS/MS與ECA呈高度相關(guān)性，提示ECA可在一定程度上作為達(dá)比加群定量的指標(biāo)，與Sinigoj等[10]和Hawes等[19]的研究結(jié)果一致，Bland-Altman偏倚性分析顯示ECA低估藥物濃度，與其他研究結(jié)果相符[17]，提示ECA不能反映總體的達(dá)比加群血藥濃度，而Skeppholm 等[20]分別比較ECA與游離型和總體的達(dá)比加群血藥濃度，得出ECA在人血漿中檢測(cè)的為總達(dá)比加群血藥濃度的結(jié)論，與本研究的結(jié)果不一致，這可能是由于種屬間的差異及應(yīng)用不同的定標(biāo)品和質(zhì)控品引起，目前尚缺乏相關(guān)的研究證實(shí)ECA反映哪一種達(dá)比加群血藥濃度。

APTT與LC-MS/MS檢測(cè)的血藥濃度相關(guān)性分析提示兩者有一定的敏感性，但相關(guān)性弱，且變異性大，正常范圍的APTT值亦不能排除存在達(dá)比加群，因此其不適合作為定量檢測(cè)達(dá)比加群的指標(biāo)，但APTT的顯著延長(zhǎng)，甚至超過儀器檢測(cè)上限，提示存在高血藥濃度，而TT與達(dá)比加群濃度有很好的劑量相關(guān)性，低濃度的達(dá)比加群即引起TT顯著延長(zhǎng)，故在排除其他引起TT值延長(zhǎng)的情況，TT可作為達(dá)比加群的定性指標(biāo)，這也與其他研究結(jié)果相符[8，11]，雖然本研究TT值未超儀器檢測(cè)上限，但以人為研究對(duì)象的研究中，TT在高濃度時(shí)易超出檢測(cè)上限[21-22]，故結(jié)合臨床實(shí)際，TT不適合作為達(dá)比加群定量的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為新西蘭大白兔，考慮不同物種間可能存在差異，為此本實(shí)驗(yàn)APTT和TT均采用比值以減少實(shí)驗(yàn)誤差，但不同實(shí)驗(yàn)室及不同檢測(cè)試劑所測(cè)結(jié)果間存在較大差異[22]，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋臨床資料時(shí)需慎重。

綜上所述，達(dá)比加群的藥代動(dòng)力學(xué)是可預(yù)測(cè)的且在體內(nèi)抗凝效果無時(shí)間延遲；APTT不適合作為定量檢測(cè)達(dá)比加群的指標(biāo)，但其值顯著升高提示高濃度的達(dá)比加群；TT可作為達(dá)比加群的定性指標(biāo)；ECA可在一定程度上作為達(dá)比加群定量的指標(biāo)，但需進(jìn)一步的研究和探討。