牛欄山白酒釀造過程中扣囊復(fù)膜酵母的分離與產(chǎn)物分析

郝文軍，劉紅霞，于曉濤，李艷敏，孫海波，朱婷婷，王英杰，魏金旺

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101300）

扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），也稱擬內(nèi)孢霉，是清香型白酒酒曲的主要上霉微生物，也是酒醅發(fā)酵階段重要的功能性微生物[1]。劉志磊等[2]通過對清香型大曲和酒醅中的酵母類微生物鑒定后發(fā)現(xiàn)1株肋狀擬內(nèi)孢霉，與模式菌株Saccharomycopsis fibuligera s5b-2相似度達(dá)99.31%。胡建華等[3]從牛欄山清香型白酒大曲及酒醅中分離得到3株擬內(nèi)孢霉，并成功應(yīng)用到醇甜基酒生產(chǎn)中，但對擬內(nèi)孢霉產(chǎn)生的醇甜成分沒有進(jìn)行深入分析；陳蕾等[4]研究發(fā)現(xiàn)，陸地扣囊復(fù)膜酵母具有高活力的淀粉酶，能水解α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵；張志才[5]將扣囊復(fù)膜酵母制成麩曲，使前期發(fā)酵醪溫度上升1℃，出酒率提高。目前，對扣囊復(fù)膜酵母的研究多集中在菌種鑒定和相應(yīng)酶活的研究上，對其代謝產(chǎn)物的研究還鮮有報道。本試驗旨在對牛欄山清香型大曲和酒醅進(jìn)行常規(guī)微生物分離，從而獲得扣囊復(fù)膜酵母菌株，并分析其代謝產(chǎn)物及與牛欄山二鍋頭白酒的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香酒醅：取自牛欄山酒廠釀酒車間。

主要試劑：酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-430型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；TD-2002B型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；YXQ-LS-75Ⅱ型壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7890B-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，115 ℃，滅菌30 min，倒平板備用。

高粱培養(yǎng)基：高粱，4瓣、6瓣、8瓣粉碎，70%沸水潤糧24 h，分裝入500 mL三角瓶中，每瓶100 g，121℃滅菌蒸糧30 min，趁熱搖散，降溫備用。

1.4 扣囊復(fù)膜酵母的分離與純化

稱取5 g清香酒醅，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶中，搖床振蕩20 min形成混懸液；移液器吸取1 mL混懸液加入到裝有9 mL無菌水的試管中，搖勻為10-2濃度；依次從試管中吸取1 mL混懸液，加入到9 mL無菌水的試管中，配制成10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度。分別取10-4、10-5、10-6混懸液在YPD平板上進(jìn)行微生物涂布分離，置于28℃下培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)并從中挑取形態(tài)不同的扣囊復(fù)膜酵母進(jìn)行平板純化，直到得到相應(yīng)的純菌落為止。

1.5 扣囊復(fù)膜酵母的培養(yǎng)

挑取1環(huán)不同的純菌落，分別置于裝有2 mL無菌水的小試管中，攪勻得到菌懸液，將該菌懸液倒入裝有高粱培養(yǎng)基的三角瓶中，搖拌均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，中途搖瓶數(shù)次。對照樣為不接種的純高粱培養(yǎng)基。

1.6 扣囊復(fù)膜酵母香氣跟蹤

通過鼻子聞香的方式對培養(yǎng)第7天和第13天的扣囊復(fù)膜酵母的香氣變化情況進(jìn)行跟蹤。

1.7 扣囊復(fù)膜酵母在高粱培養(yǎng)基中生長后代謝產(chǎn)物的測定

準(zhǔn)確稱取1 g高粱培養(yǎng)基于20 mL頂空瓶中，加入8 mL純凈水，然后加入3 g NaCl，內(nèi)標(biāo)（丙酸辛酯和薄荷醇混標(biāo)的濃度分別為60.55 ppb和125.2 ppb）10 μL。頂空固相微萃取進(jìn)樣，具體條件如下。

進(jìn)樣方式頂空自動進(jìn)樣；進(jìn)樣口：無分流進(jìn)樣。

萃取頭：三項纖維萃取頭。頂空溫度：50℃；浸提時間：40 min。

色譜柱：DB-FFAP122-3262，最高溫度250℃，60.0 m×0.25 mm×0.25 μm。載氣流量2 mL/min。

升溫程序：50℃（2 min）→4℃/min→230℃（15 min）。

離子源電壓：70 eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；輔助加熱區(qū)溫度：280℃。

質(zhì)量掃描范圍：35.0～350.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 扣囊復(fù)膜酵母的菌落形態(tài)（圖1）

圖1 不同扣囊復(fù)膜酵母的菌落形態(tài)

用接種針挑取少量菌體接種在相同的YPD平板上培養(yǎng)48 h，形成單菌落，見圖1，菌落順序從左向右依次編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5。從圖1可以看出，SF1—SF5菌落形態(tài)存在明顯差異。SF1為乳白色菌落，形態(tài)呈不規(guī)則狀，向上突起形成巨大褶皺，長滿微小絨毛，不易挑取；SF2為暗白色菌落，形態(tài)呈向上突起的圓形，長滿微小絨毛并向四周輻射生長，不易挑取；SF3為雪白色菌落，形態(tài)呈不規(guī)則圓形，向上隆起，中間扁平，長滿細(xì)小絨毛，并向外輻射生長，不易挑?。籗F4為雪白色菌落，形態(tài)呈不規(guī)則圓形，微向上隆起并伴有多條長線狀突起，中間扁平，長滿微小絨毛，不易挑??；SF5為乳白色菌落，形態(tài)不規(guī)則，向上隆起，長滿致密的絨毛，不易挑取。

2.2 培養(yǎng)時間及方式的選擇

通過早期實驗對不同發(fā)酵時間的牛欄山清香型酒醅進(jìn)行跟蹤得知，扣囊復(fù)膜酵母在入池的前3天開始大量繁殖，而后數(shù)量出現(xiàn)小幅度的下降和再上升的態(tài)勢，發(fā)酵7 d后，扣囊復(fù)膜酵母數(shù)量開始大幅度下降，直到第13天基本全部死亡，這與酒醅中氧含量有直接關(guān)系。根據(jù)這一規(guī)律，將這5株菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，前7天使用透氣的封口膜密封三角瓶，可見高粱表面長滿白色的扣囊復(fù)膜酵母菌體；7 d后改為保鮮膜密封培養(yǎng)，使三角瓶內(nèi)氧氣逐漸被消耗完，第13天結(jié)束培養(yǎng)。

2.3 扣囊復(fù)膜酵母在高粱培養(yǎng)基中的香氣分析（表1）

表1 不同扣囊復(fù)膜酵母在高粱培養(yǎng)基中的香氣變化

根據(jù)2.2中所述的扣囊復(fù)膜酵母在酒醅的變化規(guī)律，將第7天、第13天定為兩個關(guān)鍵點，通過用鼻聞,判斷這5株菌的香氣變化情況，初步確定培養(yǎng)基中是否有呈香化合物生成。從表1可以看出，SF1的香氣在第7天時呈現(xiàn)較強(qiáng)的水果香氣，第13天伴隨出現(xiàn)令人不愉快的臭味；SF2、SF4在第7天時散發(fā)出不愉快的臭味，但第13天時伴隨出現(xiàn)較弱的果香；SF3在第7天時水果香較強(qiáng)烈，第13天時果香減弱，出現(xiàn)淡淡的不愉快的臭味；而SF5在第7天時水果香較淡，第13天時果香消失，出現(xiàn)令人不愉快的臭味。綜合分析，5株扣囊復(fù)膜酵母在培養(yǎng)7 d和13 d時，均出現(xiàn)明顯的香氣變化，這說明培養(yǎng)基中確實有呈香化合物生成。

2.4 扣囊復(fù)膜酵母在高粱培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物分析（表2）

為了確定扣囊復(fù)膜酵母代謝生成的化合物類型，實驗利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對培養(yǎng)13 d的扣囊復(fù)膜酵母培養(yǎng)基進(jìn)行微量成分的半定量分析。從表2可以看出，扣囊復(fù)膜酵母在高粱培養(yǎng)基中生長繁殖時，確實可以代謝生成多種化合物，其中包括9種酯類化合物、5種內(nèi)酯類化合物、7種醇類化合物、9種萘酚類化合物、7種酸類化合物、4種醛酮類化合物，這些化合物中多數(shù)都呈現(xiàn)出特殊香氣。

王勇等[7]等利用GC-O和GC-MS技術(shù)分析牛欄山二鍋頭白酒，一次性檢測出92種香氣化合物，其中有25種香氣成分對白酒整體香氣貢獻(xiàn)最大。通過成分對比發(fā)現(xiàn)，上述5株扣囊復(fù)膜酵母的代謝產(chǎn)物中，有6種化合物是牛欄山二鍋頭白酒中重要的香氣成分，分別是苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲基丁酸、苯乙酸[7]。苯乙酸乙酯具有濃烈而甜的蜂蜜香氣；乙酸苯乙酯帶有粉香的蜂蜜樣香氣，類似蘋果樣的果香；苯乙醛具有濃郁的玉簪花香氣，稀釋后有類似水果的甜香氣；4-乙基愈創(chuàng)木酚帶有香瓜香；苯乙酸在低濃度時具有甜蜂蜜味；3-甲基丁酸有刺激性酸敗的臭味，高度稀釋后則有甜潤的果香。表2中數(shù)值顯示，5株扣囊復(fù)膜酵母在第13天的檢測中，培養(yǎng)基中的3-甲基丁酸積累量最大，推測是造成扣囊復(fù)膜酵母在聞香時伴有令人不愉快臭味的重要因素之一。

扣囊復(fù)膜酵母作為牛欄山清香型酒醅中的主要優(yōu)勢微生物，其代謝產(chǎn)生的多種呈香化合物與牛欄山二鍋頭白酒的重要香氣化合物重合，由此可以推斷，扣囊復(fù)膜酵母在牛欄山二鍋頭白酒的釀造過程中起著很重要的作用。

表2 13 d時扣囊復(fù)膜酵母代謝產(chǎn)物半定量分析

3 結(jié)論

通過對牛欄山清香型酒醅分離，得到5株菌落形態(tài)不同的扣囊復(fù)膜酵母，編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5。對這5株菌進(jìn)行純培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在第7天和第13天時，這5株菌在香氣方面發(fā)生明顯改變；通過對培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物半定量分析發(fā)現(xiàn)，扣囊復(fù)膜酵母可以代謝生成多種化合物，其中有6種化合物是牛欄山二鍋頭白酒中重要的香氣成分，分別是苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲基丁酸、苯乙酸，可以推測，扣囊復(fù)膜酵母在牛欄山二鍋頭白酒的釀造過程中起著很重要的作用。