姜萍，邢潔，紀(jì)淳望，劉英，馬洪美，姜月華

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院；3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部；4山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；5滕州市中醫(yī)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為基本病理表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病。近年大量研究顯示，RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)的過度增殖及炎癥因子的產(chǎn)生是RA發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。膽堿能抗炎通路(CAP)是一條鏈接于神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的抗炎通路[1]，國內(nèi)已有研究證實(shí)通過CAP可抑制FLS炎癥因子的分泌，減輕RA的炎癥反應(yīng)[2]。但國內(nèi)、外尚無相應(yīng)的治療RA干預(yù)藥物。我們前期研究證實(shí)，和痹方不僅能有效緩解RA患者的關(guān)節(jié)腫痛，改善實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、滑膜厚度等，而且能夠緩解神疲乏力、精神萎靡等與迷走神經(jīng)相關(guān)的全身癥狀[3,4]。本研究觀察了和痹方對RA中FLS炎癥因子分泌的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、試劑及儀器 Wistar大鼠60只，8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(150±20)g，SPF級，均購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心[合格證號為SCXK(魯)20160007]，購進(jìn)大鼠后供給充足的水和飼料，預(yù)飼養(yǎng)7 d。和痹方(當(dāng)歸20 g、白芍30 g、白術(shù)15 g、蒼術(shù)15 g、川芎20 g、防風(fēng)9 g、青風(fēng)藤20 g、腫節(jié)風(fēng)30 g、生甘草6 g)由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，每毫升含生藥1 g的溶液，經(jīng)高溫消毒封瓶，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；甲氨蝶呤?MTX，2.5 mg/片，上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司信誼制藥總廠)。PNU-282987(P6499，購于美國Sigma公司)，高遷移率組蛋白1(HMGB1)ELISA法試劑盒(HM10235)、白介素(IL)-17 ELISA法試劑盒(HM10198)均購于Bio Swamp公司，α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)兔單克隆抗體(ab76315,Abcam公司)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB亞基p65(NF-κB p65)兔多克隆抗體(10745-1-ap)、山羊抗兔二抗(SA00001-2)均購于Proteintech公司。全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher 1510)，洗板機(jī)(FCC Compliance 76883)，消毒箱(熱空氣sut6120)，酶標(biāo)儀(BIO-RAD iMARK)，電泳儀(BIO-RAD Power pac)，顯影儀(SAGECREATION Minichemi 420-k4)，超聲儀(南京先歐 XO-1000D變幅桿Ф3)。

1.2 和痹方藥物血清制備 將60只大鼠分為模型組、激動劑組、MTX組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各10只。激動劑組：PNU-282987采用IEq鹽酸溶解后再次應(yīng)用生理鹽水稀釋，按0.38 mg/kg[5]進(jìn)行腹腔注射，每天注射1次；MTX組：MTX灌胃，劑量為0.7 mg/kg[6]，每周1次；低劑量組：中藥灌胃，3 g/kg，1次/d；中劑量組：中藥灌胃，6 g/kg，1次/d；高劑量組：中藥灌胃，12 g/kg，1次/d；模型組：生理鹽水適量灌胃。灌胃持續(xù)14 d，末次灌胃3 h后下腔靜脈取血，靜置后離心，56 ℃滅活，抽濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 滑膜組織獲取及FLS分離、培養(yǎng)、鑒定 滑膜組織取材于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、山東省千佛山醫(yī)院、滕州市中醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者(患者男1例、女5例，年齡55～69歲、平均62歲，病程8～20 a，平均14.33 a)。取材前征得患者的知情同意，并簽署知情同意書。RA診斷符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)2010年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)滕州市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2018001)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]，采用消化酶培養(yǎng)法進(jìn)行FLS培養(yǎng)、傳代。將FSL加入放入蓋玻片的6孔板培養(yǎng)72 h，對細(xì)胞貼片進(jìn)行HE染色和細(xì)胞免疫組化按試劑盒操作，鼠抗人波形蛋白(vinlentin)單抗、FⅧ因子單抗、CD68單抗(均為1∶1 00稀釋)三染進(jìn)行鑒定，以非免疫鼠IgG作為陰性對照。HE染色：細(xì)胞長梭狀極向排列，分裂相少見。免疫組化：滑膜巨噬樣細(xì)胞的標(biāo)記CD68(-)、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記FⅧ因子(-)、成纖維樣細(xì)胞的表面標(biāo)記vinlentin +，符合人關(guān)節(jié)FSL特點(diǎn)。

1.4 FLS分組及和痹方藥物血清干預(yù) 將FLS移至6孔板中培養(yǎng)，隨機(jī)分為模型組、激動劑組、MTX組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。激動劑組每孔加入含10%PNU-282987藥物血清的DMEM培養(yǎng)液；MTX組每孔加入含10% MTX藥物血清的DMEM培養(yǎng)液；低劑量組每孔加入含10%低劑量和痹方藥物血清的DMEM培養(yǎng)液；中劑量組每孔加入含10%中劑量和痹方藥物血清的DMEM培養(yǎng)液；高劑量組每孔加入含10%高劑量和痹方藥物血清的DMEM培養(yǎng)液；模型組每孔加入10%DMEM血清的培養(yǎng)液。24 h后取細(xì)胞上清液及滑膜細(xì)胞。

1.5 FLS上清液中IL-17、HMGB1檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞上清液中IL-17、HMGB1。先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，設(shè)置陰性對照，用封板膜封板后置入37 ℃溫育30 min，揭去封膜，棄去液體，甩干，加洗滌液重復(fù)洗板5次。加入酶標(biāo)試劑，再次置37 ℃溫育30 min，洗板5次，加顯色液A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液終止反應(yīng)，于450 nm波長酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD值)。

1.6 滑膜細(xì)胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白檢測 采用Western blotting法。具體操作參照文獻(xiàn)[8]，結(jié)果以灰度值表示。

1.7 滑膜細(xì)胞中α7nAChR mRNA檢測 采用RT-PCR法。按常規(guī)方法取得提取滑膜組織中總mRNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成引物：5′-CAAGGCGAGTTCCAGAGGAG-3′，5′-GGGAGAAGTACACGGTGAGC-3′，擴(kuò)增條件：95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個循環(huán)。將模型組mRNA的表達(dá)處理為標(biāo)準(zhǔn)，作為“1”，其他數(shù)值為檢驗(yàn)值。具體公式如下：各組檢驗(yàn)值=2-(待測周期均值該組內(nèi)參周期均值)-(模型組待測周期均值-模型組內(nèi)參周期均值)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清液中IL-17、HMGB1的OD值比較 結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中IL-17、HMGB1的OD值比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與激動劑組比較，#P<0.05；與MTX組比較，ΔP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白及α7nAChR mRNA比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白及α7nAChR mRNA比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與激動劑組比較，#P<0.05；與MTX組比較，ΔP<0.05；與低劑量組比較，□P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

RA是—種以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞為特征。FLS是RA炎性滑膜組織中的主要細(xì)胞成分，可向關(guān)節(jié)軟骨表面遷移和侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及骨的侵蝕，最終引起關(guān)節(jié)破壞，在RA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9,10]。

和痹方是臨床治療RA的經(jīng)驗(yàn)方劑，方中當(dāng)歸、白術(shù)、蒼術(shù)、白芍疏肝健脾、活血理氣，青風(fēng)藤、腫節(jié)風(fēng)、防風(fēng)、川芎祛風(fēng)除濕、行氣活血、調(diào)通經(jīng)絡(luò)，甘草調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，白芍的有效成分白芍總苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫的作用，能夠抑制滑膜細(xì)胞的過度增殖，降低IL-1、前列腺素E2等炎癥因子水平[11]；此外，白芍還具有保肝作用，減輕藥物的不良反應(yīng)。青藤堿能夠抑制NF-κB活化，降低炎癥因子水平[12]，腫節(jié)風(fēng)具有調(diào)整機(jī)體免疫、抗炎鎮(zhèn)痛的作用，可降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1等炎癥因子水平。防風(fēng)與川芎也具有增強(qiáng)免疫力、消炎鎮(zhèn)痛的作用。前期研究結(jié)果顯示，和痹方能夠有效緩解RA患者的臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，減輕RA大鼠(CIA)的關(guān)節(jié)紅腫疼痛，降低CIA血清中IL-6、HMGB1等炎癥因子水平，減輕CIA關(guān)節(jié)軟骨的破壞[3,4,13,14]。

有研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中IL-17水平均升高，并與RA疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。IL-17是T細(xì)胞源性促炎因子，在RA發(fā)病早期即可通過上調(diào)誘導(dǎo)型氧化亞氮合酶促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞釋放一氧化氮，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-1,3,13、環(huán)氧化酶-2、IL-6、基質(zhì)降解酶以及IL-1的表達(dá)，參與骨侵蝕，促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)生[16]。同時，IL-17可以和TNF-α、γ-干擾素、IL-1β等細(xì)胞因子相互作用，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。HMGB1可促使NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶的激活，刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6及巨噬細(xì)胞炎癥蛋白，并激活吞噬細(xì)胞，誘導(dǎo)多種黏附分子的表達(dá)，是一種作用廣泛的促炎因子。已有研究證實(shí)，HMGB1的表達(dá)與ESR、CRP、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈正相關(guān)，可作為評價RA病情活動的指標(biāo)之一[17]。本實(shí)驗(yàn)顯示，中劑量組、MTX組均可顯著降低IL-17、HMGB1水平，且中劑量組IL-17降低水平不及MTX組，兩組之間的HMGB1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明中劑量和痹方與MTX更能有效的抑制研制因子IL-17與HMGB1表達(dá)。

CPA是新近研究發(fā)現(xiàn)的存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間一條具有拮抗炎癥反應(yīng)作用的通路。該通路由迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)所構(gòu)成，Ach與免疫細(xì)胞表面的α7nAChR結(jié)合后通過調(diào)節(jié)下游NF-κB信號通路，抑制促炎因子的轉(zhuǎn)錄和合成，發(fā)揮抗炎作用。α7nAChR是CAP發(fā)揮作用的關(guān)鍵受體，膽堿能激動劑激活α7nAChR后，可抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移，從而抑制炎癥因子的生成。已有實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)LS表面存在α7nAChR的表達(dá)[2]，通過上調(diào)α7nAChR的表達(dá)可抑制FLS分泌炎癥因子。但目前尚無理想藥物能夠上調(diào)α7nAChR的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激動劑組、中劑量組可上調(diào)α7nAChR蛋白表達(dá)多，減少NF-kBp65蛋白表達(dá)；MTX組可降低NF-kBp65蛋白表達(dá)；激動劑組、中劑量組可促進(jìn)α7nAChR mRNA的表達(dá)。表明中等濃度的和痹方具有上調(diào)α7nAChR mRNA與蛋白表達(dá)的作用，從而抑制NF-kB信號通路，降低炎癥因子IL-17、HMGB1等炎癥因子水平。

總之，復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是RA發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，和痹方劑能夠激活CAP，上調(diào)α7nAChR的表達(dá)，通過抑制上游的信號通路，從而降低下游炎癥因子水平，減輕關(guān)節(jié)破壞，為RA的治療開辟新的思路。