印楝素對(duì)柑橘木虱的毒力測(cè)定及田間防效試驗(yàn)

賴(lài) 多，曹 旭 ，邵雪花，肖維強(qiáng)，劉傳和，賀 涵，劉 秀 ，匡石滋

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院/湖南省農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000）

【研究意義】柑橘黃龍病是一種系統(tǒng)侵染的檢疫性細(xì)菌病害，已成為威脅世界柑橘產(chǎn)業(yè)的頭號(hào)“殺手”［1-2］。柑橘木虱是黃龍病重要的傳播媒介，防治木虱成為控制或延緩黃龍病發(fā)病和傳播的關(guān)鍵［2-3］。目前，防治柑橘木虱主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而殺蟲(chóng)劑的頻繁使用，不僅造成了靶標(biāo)害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生，而且引發(fā)了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、環(huán)境污染和生物多樣性等諸多問(wèn)題［4-6］。隨著人們生活水平的提高和農(nóng)藥減量化的要求，在柑橘木虱綜合防治中迫切需要篩選出高效、低毒的環(huán)境友好型替代農(nóng)藥。【前人研究進(jìn)展】研究表明，柑橘木虱取食黃龍病病株后可終生帶毒，成蟲(chóng)和若蟲(chóng)均具有高效獲毒和傳毒能力，在感染黃龍病病樹(shù)上刺吸5周，若蟲(chóng)60%～100%帶毒，成蟲(chóng)40%帶毒，且成蟲(chóng)通過(guò)飛行攜帶病原進(jìn)行擴(kuò)散［7-8］。柑橘木虱的發(fā)生與黃龍病的傳播、擴(kuò)散密切相關(guān)，加之木虱在柑橘的整個(gè)生長(zhǎng)期都有發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此實(shí)際生產(chǎn)中柑橘園頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥。有研究報(bào)道我國(guó)有些柑橘種植區(qū)每年噴藥防治柑橘木虱的次數(shù)少則12次、多達(dá)20次［9］。目前，生產(chǎn)上用于柑橘木虱的殺蟲(chóng)劑種類(lèi)繁多，包含各種不同作用機(jī)理的化學(xué)農(nóng)藥，如有機(jī)磷類(lèi)、新煙堿類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、阿維菌素類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)和有機(jī)氯類(lèi)等［4-5,10］。大量多次和不當(dāng)?shù)氖褂脷⑾x(chóng)劑都會(huì)導(dǎo)致柑橘木虱抗藥性水平增加，而且化學(xué)農(nóng)藥對(duì)柑橘木虱的防治已有幾十年的應(yīng)用歷史，目前許多國(guó)家的田間種群對(duì)多數(shù)傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥已產(chǎn)生了不同程度的抗性。例如，Vázquez-García等［11］研究發(fā)現(xiàn)，墨西哥 Apatzingan和Michoacan地區(qū)的柑橘木虱種群對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性高達(dá)4 265.6倍，對(duì)樂(lè)果也有106.5倍；Tiwari等［5］報(bào)道美國(guó)佛羅里達(dá)柑橘木虱田間種群對(duì)吡蟲(chóng)啉、毒死蜱、噻蟲(chóng)嗪、馬拉硫磷和甲氰菊酯均已產(chǎn)生抗藥性，其中La Balle地區(qū)對(duì)吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪的抗性倍數(shù)分別為35.0倍和13.0倍；2012年，我國(guó)學(xué)者鄧學(xué)明等［12-13］也報(bào)道廣西地區(qū)柑橘木虱對(duì)毒死蜱產(chǎn)生8.8倍的抗藥性，對(duì)呋蟲(chóng)胺產(chǎn)生17.1倍的抗藥性。近年來(lái)，柑橘木虱抗藥性不斷增加，而且每年用于防治木虱的殺蟲(chóng)劑使用量不斷增加。然而，農(nóng)藥減量增效是我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障，我國(guó)政府2015年中央1號(hào)文件也明確指出要顯著控制我國(guó)農(nóng)藥化肥的使用量，因此，生物農(nóng)藥在柑橘木虱的減量化防控體系中越來(lái)越重要。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)，我國(guó)實(shí)施到2020年農(nóng)藥零增長(zhǎng)行動(dòng)，大量推廣使用生物農(nóng)藥，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。印楝素是目前世界公認(rèn)的廣譜、低毒、低殘留的生物農(nóng)藥，其作用機(jī)制獨(dú)特，不易引起害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，而且對(duì)多種害蟲(chóng)有拒食、觸殺、胃毒和抑制生長(zhǎng)發(fā)育作用［14-16］。此外，印楝素具有內(nèi)吸性，能在植物韌皮部輸導(dǎo)［17-18］，因此在防治取食柑橘韌皮部的木虱中具有良好的優(yōu)勢(shì)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】測(cè)定并明確印楝素對(duì)柑橘木虱幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的毒殺活性和拒食活性，為柑橘木虱的生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源 于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園的九里香上采集柑橘木虱，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于網(wǎng)室中，以九里香幼苗飼養(yǎng)繁殖多代。試驗(yàn)前，將一批成蟲(chóng)（約800頭）轉(zhuǎn)接到長(zhǎng)出新葉的九里香上，讓其產(chǎn)卵1 d后移走；待卵孵化后，飼養(yǎng)至三齡若蟲(chóng)供測(cè)試。若蟲(chóng)羽化后，收集5～7 d的成蟲(chóng)用于測(cè)試。

1.1.2 供試藥劑 印楝素分析標(biāo)準(zhǔn)品（＞90%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品，以無(wú)水乙醇配制成濃度為5 000 mg/L的母液，使用時(shí)用清水（含0.01%吐溫80，下同）稀釋?zhuān)?.3%印楝素乳油：成都綠金生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑：安徽省錦江農(nóng)化有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)若蟲(chóng)的毒力測(cè)定 采用浸葉法［19］測(cè)定印楝素對(duì)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)的毒殺活性。將印楝素母液稀釋配制成0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 mg/L 5個(gè)濃度梯度藥液。將大小相近的新鮮柑橘葉片，分別浸漬不同濃度藥液15 s，取出自然晾干后，葉柄處用濕棉花包裹置于1.5 mL離心管后，放入150 mL一次性塑料杯中，再選取大小一致的柑橘木虱三齡若蟲(chóng)15頭饑餓處理2 h后接入塑料杯內(nèi)，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)。以清水（含等量乙醇溶劑）為對(duì)照。于處理后1、2、3、5、7 d分別檢查若蟲(chóng)的存活狀態(tài)，以毛刷輕觸若蟲(chóng)體表，無(wú)反應(yīng)判定為死亡，記錄死亡數(shù)，計(jì)算各處理若蟲(chóng)的死亡率和校正死亡率。

1.2.2 對(duì)成蟲(chóng)的毒力測(cè)定 采用浸葉法［19］測(cè)定不同濃度（1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L）印楝素藥液對(duì)成蟲(chóng)的毒殺活性。以清水（含等量乙醇溶劑）為對(duì)照。藥后2 d和4 d檢查成蟲(chóng)的存活狀態(tài)，以毛刷輕觸蟲(chóng)體，無(wú)反應(yīng)判定為死亡，記錄死亡數(shù)，計(jì)算各處理成蟲(chóng)的死亡率和校正死亡率。

1.2.3 田間防效試驗(yàn) 于2019年8月在廣東省饒平縣錢(qián)東鎮(zhèn)朝陽(yáng)公司貢柑柑橘園進(jìn)行，選取柑橘木虱為害的植株。試驗(yàn)設(shè)0.3%印楝素乳油800倍液、25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑3 500倍液及空白對(duì)照（清水）3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)排列，每小區(qū)2株柑橘樹(shù)。采用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器按試驗(yàn)濃度對(duì)柑橘樹(shù)冠和內(nèi)膛均勻噴霧，至葉片有少量藥液下滴為止。于施藥前，在柑橘樹(shù)的東、南、西、北、中5個(gè)方位選定為害嫩梢，標(biāo)記并記錄活若蟲(chóng)數(shù)；藥后1、3、7 d按照相同方式分別調(diào)查各小區(qū)柑橘葉片的活若蟲(chóng)數(shù)，記錄各處理存活若蟲(chóng)總數(shù)，計(jì)算防治效果。

根據(jù)各處理的死亡率和校正死亡率數(shù)據(jù)，用Excel進(jìn)行毒力回歸計(jì)算，得到毒力回歸方程、LC50、置限區(qū)間值和相關(guān)系數(shù)；采用GraphPad Prism 8數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行差異顯著性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的室內(nèi)毒殺活性

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的毒殺效果較為緩慢，藥液處理的前2 d死亡率較低，但是部分若蟲(chóng)出現(xiàn)活動(dòng)能力下降、身體僵硬等現(xiàn)象，這可能與印楝素抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育而非直接致死的作用方式有關(guān)。從圖1可以看出，印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的毒殺活性與藥劑濃度以及作用時(shí)間有關(guān)，在最低處理濃度0.375 mg/L作用下，藥后2 d內(nèi)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)死亡率為0，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，若蟲(chóng)的死亡率增大，藥后3、5、7 d死亡率分別為11.11%、31.11%和44.44%，并且隨著印楝素處理濃度的增大，若蟲(chóng)的死亡率明顯增高。在最大處理濃度6.0 mg/L作用下，印楝素對(duì)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)具有良好的毒殺活性，藥后1、2、3、5、7 d，三齡若蟲(chóng)死亡率分別為2.22%、13.33%、68.89%、82.22%和91.11%。顯著性分析表明，藥后7 d各藥劑處理與對(duì)照死亡率差異顯著。由表1可知，印楝素對(duì)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)的毒殺活性隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，藥后3、5 d其LC50值分別為2.77、1.14 mg/L；藥后7 d活性最高，其LC50值為0.61 mg/L。

圖1 印楝素對(duì)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)的死亡率測(cè)定Fig.1 Determination of mortality of the 3rd instar nymphs of D. citri treated with azadirachtin

2.2 印楝素對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)的室內(nèi)毒殺活性

從圖2可以看出，與若蟲(chóng)相比，盡管印楝素對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)的處理濃度提高了，藥后2 d各處理成蟲(chóng)死亡率在2.22%～6.67%之間，與對(duì)照無(wú)顯著差異；在最大藥液測(cè)試濃度（16.0 mg/L）下，印楝素處理藥后4 d成蟲(chóng)死亡率也僅為13.33%，與清水對(duì)照無(wú)顯著差異。表明印楝素在低濃度情況下對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)無(wú)毒殺活性。

表1 印楝素對(duì)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)的室內(nèi)毒殺活性Table 1 Indoor toxicity activity of azadirachtin against the 3rd instar nymphs of D. citri

圖2 印楝素對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)的死亡率測(cè)定Fig.2 Determination of mortality of the adult of D. citri treated with azadirachtin

2.3 印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的田間防效

從表2可以看出，0.3%印楝素乳油800倍液藥后1、3、7 d對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的防效分別為14.35%、49.56%和86.4%，防效隨著時(shí)間延長(zhǎng)而提高；而對(duì)照藥劑25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑表現(xiàn)出速效性，藥后1、3 d的防效分別達(dá)到99.32%和98.12%，顯著高于0.3%印楝素乳油處理。但藥后7 d，0.3%印楝素乳油對(duì)柑橘木虱具有良好的防治效果，可以將若蟲(chóng)密度控制在較低的水平，與對(duì)照藥劑25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑的防效無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，0.3%印楝素乳油對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的速效性較差，并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)印楝素對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)沒(méi)有防治效果，這與室內(nèi)活性測(cè)定結(jié)果一致。

表2 0.3%印楝素乳油對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的田間防效Table 2 Field control effect of 0.3% azadirachtin EC on the nymphs of D. citri (%)

3 討論

本試驗(yàn)測(cè)定了印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)和成蟲(chóng)的毒殺活性及田間防治效果，評(píng)價(jià)了印楝素在柑橘木虱防治工作中的應(yīng)用潛力。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)具有良好的毒力，但對(duì)成蟲(chóng)沒(méi)有毒殺活性。這與印楝素獨(dú)特的作用機(jī)理有關(guān)，印楝素主要通過(guò)干擾昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，降低蛻皮激素滴度進(jìn)而抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育［16,20］。值得注意的是，印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的速效性較差，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一般藥后3～5 d才能觀察到明顯的死亡現(xiàn)象。在其他害蟲(chóng)如大豆蚜Aphis glycines、鬧羊花網(wǎng)蝽Stephanitis pyrioides、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda等［21-23］防治中，也發(fā)現(xiàn)印楝素的毒殺作用見(jiàn)效均較慢。這些現(xiàn)象與除蟲(chóng)脲、滅幼脲、吡丙醚等其他昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用效果類(lèi)似，在使用時(shí)不直接殺死昆蟲(chóng)，而是在昆蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期阻礙或干擾其正常發(fā)育，使其活動(dòng)能力下降、死亡，進(jìn)而控制種群的密度［24］。因此，印楝素需要在柑橘木虱若蟲(chóng)低齡期施用，或與低毒的速效殺蟲(chóng)劑復(fù)配使用，既有速效作用又能發(fā)揮印楝素的特異性。

抗藥性是目前柑橘木虱防治中面臨的重要問(wèn)題之一。柑橘木虱作為黃龍病的田間唯一傳播媒介昆蟲(chóng)，鑒于黃龍病的破壞性，果農(nóng)在柑橘園中頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥，長(zhǎng)期以來(lái)常規(guī)的有機(jī)磷類(lèi)、新煙堿類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥單一品種和高劑量的使用，進(jìn)一步加劇了木虱的抗藥性。與化學(xué)農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥尤其是植物源農(nóng)藥往往具有多重作用機(jī)制，不易引起昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，已經(jīng)成為害蟲(chóng)防治中的重要手段之一［15,25］。印楝素是目前世界上公認(rèn)的最優(yōu)秀植物源農(nóng)藥，由于其獨(dú)特的作用機(jī)理，對(duì)害蟲(chóng)無(wú)抗藥性，而且低毒、低殘留，對(duì)人畜和環(huán)境安全。印楝素在柑橘木虱防治中具有良好的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，印楝素對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)具有良好的毒力，但對(duì)成蟲(chóng)沒(méi)有毒殺活性。6.0 mg/L印楝素對(duì)柑橘木虱三齡若蟲(chóng)藥后7 d的LC50值為0.61 mg/L，0.3%印楝素乳油800倍液對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)藥后7 d的田間防效為86.4%。