李艷麗 宋 琛 李冬靜 王艷芬 趙淑蕊

河北省唐山市豐南區(qū)醫(yī)院(063300)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期婦女特發(fā)疾病[1]。不僅造成孕婦免疫功能下降，還可影響孕婦的抗氧化能力等一系列血清學(xué)表現(xiàn)，尋找診斷標(biāo)志物具有臨床意義[2]。研究表明微小RNA-181b(miR-181b)可在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能并參與多種疾病的發(fā)生進(jìn)展[3]。相關(guān)研究表明微小RNA-210(miR-210)在子癇前期孕婦的胎盤組織及外周血中均呈高表達(dá)，并與子癇前期的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。關(guān)于miR-181b、miR-210在妊娠期高血壓疾病中的研究相對較少，因此本研究探討miR-181b、miR-210聯(lián)合檢測的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月—2017年2月本院治療的妊娠期高血壓疾病患者作為觀察組，另選取同期健康檢查孕婦為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]；②單胎妊娠；③無原發(fā)性高血壓。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病、腎臟或血液系統(tǒng)疾??；②肝腎功能嚴(yán)重?fù)p傷；③多胎妊娠；④凝血功能障礙；⑤心肺功能不全。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；QPCR試劑盒購自日本Ta KaRa公司；qRT-PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；Nanodrop核酸測定儀器購自德國NanolytiK公司；CFX96PCR儀器購自Beckman公司。

1.3 qRT-PCR法檢測miR-181b、miR-210

采集所有孕婦清晨空腹靜脈血抗凝后離心，血清-20℃保存。采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green RCR master mix試劑說明配反應(yīng)體系并加樣。qRT-PCR反應(yīng)體系共為20μl，其中SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μl，dd H2O 6.0μl。miR-181b、miR-210均以U6為內(nèi)參基因，引物設(shè)計見表1。q RT-PCR反應(yīng)條件：98℃30s，95℃15s，72℃15s，共40個循環(huán)。對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-181b、miR-210的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)及觀察指標(biāo)

通過ROC曲線分別評估m(xù)iR-181b、miR-210妊娠期高血壓疾病最佳截斷值，聯(lián)合檢測時有一項為陽性即判定為陽性，并評估不同診斷方案相關(guān)指標(biāo)。采用免疫比濁法測定血清C反應(yīng)蛋白(CRP)指標(biāo)，循環(huán)酶法測定血清同型半胱氨酸(Hcy)指標(biāo)，觀察血清總抗氧化能力(TAC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以(±s)表示，多組間比較行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析；采用ROC評估m(xù)iR-181b、miR-210診斷價值及最佳截斷值。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦一般資料比較

兩組各納入96例，兩組孕婦年齡、孕周比較無差異(P＞0.05)，觀察組孕婦血清Hcy、CRP、MDA水平高于對照組，TAC、SOD、GSH-Px水平低于對照組(P＜0.05)，見表2。

2.2 血清miR-181b與miR-210表達(dá)及與臨床指標(biāo)相關(guān)性

觀察組血清miR-181b(2.14±0.23)、miR-210(1.27±0.15)水平均高于對照組(1.02±0.16、0.98±0.13)(P＜0.05)?；颊哐錷iR-181b、miR-210水平均與Hcy、CRP、MDA呈正相關(guān)，與TAC、SOD呈負(fù)相關(guān)(均P＜0.05)；與GSH-Px無相關(guān)性(P＞0.05)，見表3。

表2 兩組孕婦一般資料比較(±s)

表2 兩組孕婦一般資料比較(±s)

項目 對照組(n＝96)研究組(n＝96) t P 項目 對照組(n＝96)研究組(n＝96) t P年 齡(歲) 29.1±4.2 28.5±3.9 1.048 0.296 TAC(U/ml) 13.36±4.45 8.56±2.85 8.900 0.000孕 周 25.6±4.6 25.3±3.9 0.507 0.613 MDA(μmol/L)21.27±7.09 28.83±9.61 6.203 0.000 Hcy(μmol/L) 10.30±3.43 15.23±5.04 7.923 0.000 SOD(n U/ml) 96.37±6.55 86.19±5.36 11.785 0.000 CRP(mg/dl) 1.45±0.48 2.01±0.67 6.657 0.000 GSH-Px(U/L)93.16±6.58 84.27±7.12 8.985 0.000

表3 miR-181b、miR-210表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性

2.3 miR-181b與miR-210診斷效能

miR-181b診斷ROC曲線AUC為0.888，最大約登指數(shù)0.773，截斷值1.50，此時靈敏度57.3%，特異度76.0%，見 圖1。miR-210診 斷ROC曲 線AUC為0.908，最大約登指數(shù)0.732，截斷值為1.10，此時靈敏度55.2%，特異度為75.3%，見圖2。

圖1 miR-181b ROC曲線

圖2 miR-210 ROC曲線

2.4 聯(lián)合檢測與單項檢測診斷效能對比

將單項檢測與聯(lián)合檢測診斷效能對比分析，miR-181b＋miR-210聯(lián)合檢測時診斷靈敏度、準(zhǔn)確度均高于單項檢測(P＜0.05)，見表4。

表4 各檢測方法診斷效能比較(%)

3 討論

妊娠高血壓疾病以高血壓、蛋白尿、水腫等全身功能紊亂為主要臨床特征[6]。以往研究認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能異常會引起母體胎盤缺血缺氧導(dǎo)致臨床癥狀進(jìn)而嚴(yán)重影響胎兒生長發(fā)育，而部分研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)失調(diào)是發(fā)病主要因素[7-8]。miRNAs可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生理病理過程，在滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)異常與妊娠類疾病發(fā)生有關(guān)[9]。在血流中含量豐富且樣本易獲得、重復(fù)性高，一些血清/血漿中的miRNAs有望成為妊娠相關(guān)疾病診斷的標(biāo)志物。因此，研究miRNAs對妊娠期高血壓疾病診斷具有重要臨床意義。

相關(guān)研究表明，miR-181b可參與T細(xì)胞、B細(xì)胞分化調(diào)控及免疫應(yīng)答過程[10]；可在子宮內(nèi)膜與早孕脫膜中表達(dá)并參與蛻膜化及維持早孕過程[11]；可通過調(diào)控靶基因金屬肽酶抑制劑3(TIMP3)表達(dá)而參與妊娠期高血壓疾病及其引起的心臟病發(fā)生發(fā)展過程[12]。本研究觀察組血清miR-181b水平高于對照組。有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓疾病患者Hcy、CRP、TAC、MDA、SOD、GSH-Px等表達(dá)異常[13]。本研究結(jié)果顯示觀察組血清Hcy、CRP、MDA水平均高于對照組，TAC、SOD及GSH-Px水平降低，miR-181b與Hcy、CRP、MDA呈正相關(guān)，與TAC、SOD呈負(fù)相關(guān)。miR-210在細(xì)胞增殖、分化及對低氧的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用[14]。孕婦體內(nèi)高表達(dá)miRNA-210可引起滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常導(dǎo)致胎盤血液供應(yīng)不足[15]。在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞上miRNA-210上調(diào)表達(dá)并可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖及線粒體呼吸等過程[16]。缺氧狀態(tài)下miRNA-210表達(dá)升高可用于篩查孕婦子癇前期發(fā)病風(fēng)險[17]。miRNA-210可參與多種妊娠相關(guān)疾病的發(fā)病過程并可作為潛在生物標(biāo)志物[18]?；诖?，本研究檢測血清miRNA-210水平顯示，觀察組miRNA-210水平高于對照組，且miR-210與Hcy、CRP、MDA呈正相關(guān)，與TAC、SOD呈負(fù)相關(guān)。miR-181b、miR-210均與妊娠高血壓疾病發(fā)生有關(guān)，提示其可能作為臨床診斷妊高癥的重要指標(biāo)。ROC曲線分析顯示，miR-181b、miR-210診斷妊娠期高血壓疾病均具有一定靈敏性與特異性，而二者聯(lián)合檢測診斷靈敏度、準(zhǔn)確度均提高。

綜上所述，miR-181b、miR-210在妊娠期高血壓疾病患者血清中表達(dá)升高，二者聯(lián)合檢測可提高診斷效能。本研究僅對患者血清水平進(jìn)行檢測，胎盤組織中二者表達(dá)情況及其具體作用還有待深入研究。