丁春燕 劉青杰 封江彬 田 梅 陸 雪 李 爽 高 玲*

早熟衰老或早衰(premature senescence)是指細胞在非端粒信號刺激下發(fā)生增殖能力和生理功能下降，是細胞在生長和發(fā)育的過程中，形態(tài)和功能發(fā)生變化，提前出現(xiàn)退行性改變，這種形式的衰老與端?？s短無關，也與細胞增殖代數(shù)無關聯(lián)，屬于病理性衰老。能誘導細胞早衰的刺激因素包括DNA受損、氧化應激和一些致癌基因的表達變化等。電離輻射誘導癌細胞早衰的相關研究結果表明：電離輻射可誘導乳腺癌MCF-7細胞和人間充質干細胞等發(fā)生早衰[1-2]。電離輻射誘導細胞早衰的信號通路較為復雜，不同研究者在不同的癌癥上進行了初步探討。如Wang等[3]的研究表明，8 Gy的γ射線可誘導骨髓基質細胞經(jīng)由p53/p21通路誘導細胞早衰；Kim等[4]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞HepG2存在不依賴于p53/p21通路，而是由p16介導的輻射誘導的細胞早衰。2013-2014年陸續(xù)有課題報道，輻射可誘發(fā)肺癌細胞發(fā)生早熟衰老[5-7]。然而，其研究僅限于揭示早衰現(xiàn)象及檢測下游早衰相關分子p53和p16等，而對其更上游的與放射損傷早期反應密切關聯(lián)的調節(jié)機制還有待更深入的研究闡述。

STAT3是一種將細胞外信號傳遞至細胞核的轉錄因子，位于羧基端第705位的酪氨酸磷酸化使其激活，并從細胞質轉位到細胞核，調控靶基因的表達，將受體激發(fā)的短暫的胞漿信號轉化為長期的基因表達的改變，其參與細胞生長、惡性轉化、凋亡等生理功能的調控，并在多種腫瘤中的表達持續(xù)性升高[8]。有研究表明，STAT3是導致衰老的早期和晚期事件所必需的，包括引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)簇早期增加和衰老相關分泌表型(senescenceassociated secretory phenotype，SASP)的產生，涉及白介素6(interleukin-6，IL-6)-STAT3-IGFBP5信號通路[9]。

STAT3是目前得到廣泛認可的輻射誘導表達基因，本研究的前期研究結果發(fā)現(xiàn)，2 Gy劑量電離輻射可以激活肺腺癌細胞內STAT3，繼而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[10-11]。通過抑制劑阻斷輻射誘導的STAT3活化，可以有效逆轉輻射誘導的A549細胞侵襲和遷移[12]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量X射線可誘導A549細胞出現(xiàn)劑量依賴性早衰[13]。目前STAT3介導的抗早衰影響肺腺癌細胞輻射抗性的機制目前還不明確。因此，本研究進一步探討STAT3在X射線誘導A549細胞早衰中的作用。

1 材料與方法

1.1 設備材料與試劑

(1)直線加速器(瑞典Elekta公司Precise)；Thermo Forma培養(yǎng)箱(美國Thermofisher公司)；DT5-2型低速臺式離心機(北京時代北利)。

(2)人肺腺癌A549細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學院細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和最低需求(minimum essential medium，MEM)培養(yǎng)基購自美國HyClone；青霉素-鏈霉素溶液、β-半乳糖苷酶細胞染色試劑盒、RIPA細胞裂解液和BCA蛋白定量測定試劑盒以及增強化學發(fā)光液均購自江蘇碧云天；細胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；Lip2000轉染試劑盒購自美國invitrogen；羅氏磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑，1∶1000稀釋的STAT3(美國CST)，1∶1000稀釋的p-STAT3抗體(英國Abcam)，1∶2000稀釋的β-actin抗體、1∶3000稀釋的二抗山羊抗兔抗體和1∶3000稀釋的山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 細胞照射

取對數(shù)生長期A549細胞，火箭軍總醫(yī)院放射治療中心直線加速器(瑞典Elekta公司Precise)照射，源皮距離(source skin distance，SSD)為100 cm，X射線能量為6 MV，劑量率為400 cGy/min，用電離室對6 MV高能X射線(簡稱X射線)在水模體內進行劑量校準，細胞用75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，照射時培養(yǎng)瓶內含10 ml的10%FBS的培養(yǎng)液，A549細胞為貼壁細胞，瓶底中心點吸收劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy以及8 Gy，照后各劑量均分為對照組、α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490)組和雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)組共3組。

1.3 細胞處理

A549細胞照射后均分的對照組、AG490組和RAPA組，每組以105/ml鋪于6孔板中，每孔加入2 ml的細胞培養(yǎng)液，對照組不做處理，AG490組加入終濃度為20 μM/ml的AG490抑制劑，RAPA組加入終濃度為1μM/ml的RAPA抑制劑，于24 h、48 h及72 h進行β-半乳糖苷酶細胞染色實驗并計數(shù)；4 Gy劑量X射線照射的A549細胞于24 h、48 h及72 h收取細胞，同時將4 Gy照射的3組細胞，4 Gy組、4 Gy+AG490組加入終濃度為20 μM/ml的AG490抑制劑、4 Gy+RAPA組加入終濃度為1 μM/ml的RAPA抑制劑，對照組為0 Gy照射，于72 h收取細胞，全部提取蛋白用于蛋白免疫印跡實驗。

1.4 β-半乳糖苷酶細胞染色檢測細胞衰老

將A549細胞鋪于24孔板中培養(yǎng)1 d，吸除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入250 μl的β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后，吸除細胞固定液，PBS洗滌細胞3次，每次3 min。加入250 μl染色工作液，避光用保鮮膜封住24孔板防止蒸發(fā)。37 ℃溫箱孵育過夜后，加入0.5 ml的PBS，普通光學顯微鏡下觀察染色結果并計數(shù)，顯微鏡下(100×)5個隨機視野中計數(shù)陽性(細胞體積一半以上藍色)和總細胞的數(shù)目，統(tǒng)計β-半乳糖苷酶陽性細胞的百分比。

1.5 細胞轉染

A549細胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，以106/ml種植于6孔板中，每孔加入2 ml的細胞培養(yǎng)液，待培養(yǎng)細胞融合度到70%時，進行細胞轉染。轉染步驟參照Lip2000轉染說明書。將空載pcDNA3.0和STAT3過表達(pcDNA3.0-STAT3)質粒轉染至細胞，分別命名為pcDNA3.0和pcDNA3.0-STAT3組，于轉染后36 h收取細胞，用于蛋白免疫印跡實驗檢測蛋白表達。

1.6 蛋白質印跡

RIPA細胞裂解液裂解A549細胞，加入磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑，冰浴振蕩30 min，12000 r/min離心10 min取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min后以12000 r/min，離心3 min。取上清加入制備好的10%的分離膠與5%的濃縮膠，調整各上樣量至50 μg，濃縮膠以80 V電壓，分離膠以120 V的電壓電泳。使用PVDF膜，以18 V電壓半干轉轉膜120 min。5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，一抗孵育4 ℃搖床過夜。TBST洗膜3次，每次15 min，加入二抗孵育60 min，使用增強化學發(fā)光法顯色，用BIO-RAD公司ChemiDoc多功能成像系統(tǒng)曝光成像，采集圖像數(shù)據(jù)后，以β-actin為內參，Image Lab分析軟件分析目的蛋白的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩組比較采用獨立樣本，每個處理組均與對照組或0 Gy組比較，采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 STAT3參與A549細胞早衰調控

為驗證STAT3是否參與A549細胞早衰的調節(jié)，使用過表達質粒pcDNA3.0-STAT3轉染使STAT3活化，利用STAT3信號通路抑制劑AG490和雷帕霉素(RAPA)阻斷A549細胞中的STAT3活化，觀察A549細胞的早衰變化，其結果如圖1所示。

圖1 過表達和抑制STAT3對A549細胞早衰的影響結果示圖

圖1A中pc DNA-3.0和pc DNA3.0-STAT3組p-STAT3蛋白水平依次為：1、1.413；STAT3蛋白水平依次為：1、0.983。過表達STAT3后，A549細胞內的磷酸化STAT3(p-STAT3)水平顯著升高。圖1D加入AG490和RAPA后，對照組、AG490組和RAPA組p-STAT3蛋白水平依次為：1、0.545和0.397；STAT3蛋白水平依次為：1、0.966、1.076。A549細胞內的磷酸化STAT3(p-STAT3)水平顯著降低，表明所用兩種抑制劑均能顯著抑制A549細胞中的STAT3活化；進一步利用β-半乳糖苷酶細胞染色檢測細胞衰老結果顯示，過表達STAT3可引起A549細胞早衰增加(圖1A、B及C所示)，其差異有統(tǒng)計學意義(t=22.32，P＜0.05)。STAT3抑制劑AG490和RAPA處理均能顯著抑制A549細胞早衰(圖1D、E及F所示)，其差異有統(tǒng)計學意義(AG490組t=8.5，RAPA組t=5.5，P＜0.05)，表明STAT3參與A549細胞早衰調控過程。

2.2 AG490和RAPA抑制劑對X射線誘導的A549細胞內STAT3激活的抑制

在前期的研究中已經(jīng)證實，X射線照射可引起A549細胞中STAT3磷酸化水平升高，在本研究中進一步檢測AG490和RAPA是否能抑制X射線照射誘導的A549細胞內STAT3激活，其結果如圖2所示。

圖2 不同處理A549細胞蛋白表達電泳圖

圖2A顯示，4 Gy的X射線照射后0 h、24 h、48 h以及72 h p-STAT3蛋白水平依次為1、1.822、1.597和1.287；STAT3蛋白水平依次為：1、1.376、1.92和2.093。圖3B顯示，0 Gy、4 Gy、4 Gy+AG490以及4Gy+RAPA p-STAT3蛋白水平依次為1、1.379、1.230和0.710；STAT3蛋白水平依次為1、1.880、0.986和0.992。A549細胞內p-STAT3水平顯著升高，加入AG490和RAPA后，4 Gy的X射線照射誘導的p-STAT3升高被顯著抑制。

2.3 AG490和RAPA對抑制劑X射線照射引起的細胞早衰的抑制

利用β-半乳糖苷酶細胞染色實驗觀察AG490和RAPA對X射線誘導的A549細胞早衰的影響，X射線照射可顯著促進A549細胞早衰，加入AG490和RAPA后，X射線照射誘導的A549細胞早衰被顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義，表明X射線照射通過激活STAT3信號通路促進A549細胞早衰。AG490組2 Gy，4 Gy和8 Gy與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=27.7，t=3.1，t=5.8；P＜0.05)；RAPA組2 Gy、4 Gy和8 Gy與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.2，t=12.8，t=8.4；P＜0.05)，如圖3所示。

圖3 X射線照射引起的A549細胞早衰示圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)STAT3參與A549細胞早衰調控，同時發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑可抑制X射線誘導的A549細胞內STAT3激活，進而抑制X射線照射引起的細胞早衰。

Kojima等[9]研究表明，STAT3在人原代成纖維細胞中參與誘導細胞早衰，而本研究結果與此一致。同時，其他的課題組以及本研究均發(fā)現(xiàn)電離輻射在殺傷腫瘤細胞的同時，還會激活肺腺癌細胞內STAT3的表達[14-15]并促進肺腺癌細胞的轉移[16]且轉移能力的增加依賴于STAT3活性的增加。AG490和RAPA分別是JAK2和JAK-STAT通路的抑制劑，均可以抑制STAT3的表達。電離輻射可能是通過激活JAK2或JAK-STAT途徑激活STAT3的表達，從而影響細胞早衰的發(fā)生。使用AG490和RAPA處理后，電離輻射誘導的STAT3的活性增加和細胞早衰的發(fā)生均受到抑制，這提示電離輻射誘發(fā)的細胞早衰部分依賴于STAT3的激活。

已知輻射可誘發(fā)肺癌細胞發(fā)生早熟衰老[5-7]。但目前的研究僅限于揭示早衰現(xiàn)象及檢測下游早衰相關分子p53和p16等，而對其更上游的與放射損傷早期反應密切關聯(lián)的調節(jié)機制，以及下游激活早衰蛋白的機制還有待更深入的研究闡述，這也是下一步的工作重點。