張華林，趙曉鐸，李倩倩，劉光磊

（光明牧業(yè)有限公司/上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436）

熱應(yīng)激會對奶牛造成嚴重危害（圖1），進而影響牧場經(jīng)濟效益[1]。耐熱奶牛品種（品系）培育受到國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注，研究資料表明，直腸溫度是判斷奶牛是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)，其遺傳力在0.25～0.65，在熱應(yīng)激狀態(tài)下直腸溫度較低的奶牛具有更強的抗熱應(yīng)激能力[2]。以日均直腸溫度和早上6∶00直腸溫度作耐熱性標(biāo)記，根據(jù)體溫的高低估計耐熱系數(shù)，系數(shù)越高表示耐熱能力越強[3]。Turner報道，奶牛直腸溫度和生產(chǎn)力存在負相關(guān)，即選育直腸溫度低的奶牛品種，有利于提高奶牛生產(chǎn)力[4]。West的研究也發(fā)現(xiàn)，奶牛耐熱性和生產(chǎn)性能的相關(guān)性大約為-0.3[5]。近年來分子遺傳學(xué)作為一種新方法應(yīng)用于研究奶牛熱應(yīng)激的敏感度和耐受力[6]，有一大批抗熱應(yīng)激基因被發(fā)掘出來；此外全基因組檢測分析（GWAS）也被應(yīng)用于奶?？篃釕?yīng)激分子標(biāo)記的篩選工作[7,8]。本文對熱應(yīng)激給奶牛造成的危害及奶?？篃釕?yīng)激育種相關(guān)研究進展作了簡要綜述。

圖1 奶牛熱應(yīng)激狀態(tài)下行為和生理指標(biāo)發(fā)生變化的趨勢

1 熱應(yīng)激對奶牛的危害

荷斯坦牛的最適泌乳溫度為5～20℃（NRC，2001），通常用THI（溫濕指數(shù)）來衡量奶牛熱應(yīng)激狀態(tài)，學(xué)者根據(jù)奶牛生產(chǎn)性能的降低和體溫及其他生理狀態(tài)的改變進行界定[9]：①THI＜72時奶牛處于正常狀態(tài)；②72≤THI＜80時奶牛處于中度應(yīng)激狀態(tài)；③THI≥80則奶牛處于高度應(yīng)激狀態(tài)；④THI超過96則會發(fā)生死亡。即THI大于72時奶牛均處于熱應(yīng)激狀態(tài)[10]。最新研究表明，對于高產(chǎn)奶牛THI閾值應(yīng)由72降至68[11]，隨著THI升高，奶牛的產(chǎn)奶量和繁殖受胎率會顯著下降[1,12]。對牧場來說，熱應(yīng)激在奶牛生產(chǎn)性能和繁殖性能兩個方面的危害表現(xiàn)最為突出（圖2）。

1．1 熱應(yīng)激影響奶牛的健康和生產(chǎn)力

有研究發(fā)現(xiàn)，THI與泌乳牛干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量呈顯著負相關(guān)[1,13,14]，此外還會造成奶牛的代謝紊亂，使供給胃腸道的血流量下降，造成腸道缺血，導(dǎo)致腸道損傷，這也是熱應(yīng)激狀態(tài)下牛奶產(chǎn)量下降的主要原因（占50%權(quán)重）[15,16]。熱應(yīng)激也會影響哺乳犢牛的生長發(fā)育，與環(huán)境溫度20℃時相比，犢牛在熱應(yīng)激狀態(tài)下（30～40℃）最初幾天的采食量會降低12%[17]，此時改善犢牛舍條件（尤其是下午）緩解熱應(yīng)激可顯著增加采食量[18,19]。干奶期處于熱應(yīng)激狀態(tài)會影響奶牛乳腺發(fā)育，進而降低下一泌乳期的產(chǎn)奶量。Tao等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度超過21℃時，對干奶牛采取風(fēng)扇+噴淋的防暑降溫措施，下一胎次泌乳早期的產(chǎn)奶量會增加5kg/d。熱應(yīng)激會降低新產(chǎn)牛的采食量，促使新產(chǎn)牛能量負平衡加劇，危害其健康和生產(chǎn)性能。與20℃相比，熱應(yīng)激狀態(tài)下（30～40℃）奶牛的干物質(zhì)采食量可降低28%，后續(xù)產(chǎn)奶量降低29%[20]。

1．2 熱應(yīng)激影響奶牛的繁殖性能

圖3 熱應(yīng)激通過對下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)而影響奶牛繁殖表現(xiàn)[21]

熱應(yīng)激會影響奶牛的內(nèi)分泌系統(tǒng)（圖3），進而影響奶牛的繁殖性能[21,22]。研究顯示，配種前月平均每日最高THI與奶牛妊娠率存在高度相關(guān)（r=0.82）[23]，配種后THI＜55時無妊娠早期終止情況發(fā)生，超過65時妊娠早期終止率上升至8%，而THI超過69時則導(dǎo)致妊娠早期終止率達到12%[24]。

2 抗熱應(yīng)激性能奶牛選育的研究進展

2．1 通過奶牛紅細胞鉀水平選育耐熱奶牛

奶牛紅細胞鉀濃度呈正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀分布規(guī)律，是評定奶牛耐熱性的重要指標(biāo)，耐熱奶牛紅細胞鉀濃度較低。賴登明等建議以550mg/L作為選擇標(biāo)準[25]；劉玉慶建議耐熱母牛的選擇標(biāo)準是紅細胞鉀含量必須在800mg/L以下[26]；史彬林則建議以550mg/L為標(biāo)準，選擇強度20%，以縮短耐熱奶牛群選育周期[27]。對于紅細胞鉀的選擇標(biāo)準還要根據(jù)不同的品系、地理位置和育種目標(biāo)等實際情況來確定。

2．2 通過雜交手段培育耐熱品種（品系）

有學(xué)者認為，可以引入抗熱能力較強的品種（如娟姍牛、瑞士褐牛）來改良本地奶牛，也可以引入熱帶地區(qū)的奶牛品系進行改良。國內(nèi)有報道的是娟荷雜交模式，發(fā)現(xiàn)與荷斯坦牛相比，娟荷雜交牛耐熱性能較強。劉慶華通過研究熱應(yīng)激對奶牛血液流變學(xué)、生化指標(biāo)、免疫功能、抗氧化特性的影響，分析奶牛HSP70等熱應(yīng)激相關(guān)基因表達及其多態(tài)性與耐熱性的關(guān)系，從耐熱應(yīng)激機理得出娟荷雜交牛比荷斯坦牛更能適應(yīng)熱帶和亞熱帶地區(qū)高溫高濕的氣候條件[28]。梁學(xué)武等也在嘗試培育含25%～75%娟姍血液的荷-娟耐熱新品系[29]。

在通過雜交手段選育抗熱應(yīng)激品種方面，做得最成功的當(dāng)屬以色列。從20世紀40年代起，以色列以當(dāng)?shù)啬膛Ｆ贩N（大馬士革牛、巴拉迪牛）為基礎(chǔ)，開始引進國外公牛，但是從1963年以后就停止引種，基本使用國內(nèi)的公牛凍精，并制定和嚴格執(zhí)行國內(nèi)育種改良計劃，最終培育出了適應(yīng)當(dāng)?shù)馗邿岘h(huán)境的高產(chǎn)品種——以色列荷斯坦牛。目前以色列95%的奶牛均為該品種牛，單產(chǎn)水平和抗熱應(yīng)激性能均表現(xiàn)優(yōu)秀[30]。

2．3 通過分子標(biāo)記輔助選擇選育耐熱品種（品系）

奶牛耐熱性是數(shù)量性狀，遺傳力較低，常規(guī)育種效果不明顯，而以分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）為代表的分子育種可獲得較快的遺傳進展，已成為選育抗熱應(yīng)激奶牛的新突破點[31]。目前，在與奶?？篃釕?yīng)激有關(guān)的遺傳標(biāo)記研究中，HSP70、S441、S463、S2011、S275、HSF1、ATP1A1和ATP1B2等基因可作為奶牛耐熱性狀的候選基因，相關(guān)研究進展如下：

2.3.1 HSP70基因

熱休克蛋白70（HSP70）作為一種重要的分子伴侶，在熱應(yīng)激狀態(tài)時，表達量迅速增加，能夠緩解細胞所受傷害，可增強機體對熱應(yīng)激的抵抗力。陳強等采用PCR-SSCP方法對娟姍牛和荷斯坦牛HSP70基因5′-側(cè)翼區(qū)多態(tài)性及基因型進行了初步檢測和研究，認為其能否作為奶?？篃釕?yīng)激選育的分子遺傳標(biāo)記還有待證實[32]。杜方磊等利用PCR-SSCP和測序技術(shù)研究了541頭中國荷斯坦牛HSP70基因3'-非翻譯區(qū)的多態(tài)性及其對奶牛產(chǎn)奶性狀和耐熱性狀的影響，認為HSP70基因可以作為抗熱應(yīng)激的遺傳標(biāo)記[33]。Li等檢測了890頭中國荷斯坦牛HSP70基因3'-非翻譯區(qū)的多態(tài)性，以及不同組織中HSP70基因的mRNA表達水平，進一步肯定HSP70基因可以作為抗熱應(yīng)激的奶牛選育分子遺傳標(biāo)記[34]。

2.3.2 S441和S463基因

胡雄貴等以產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)變化和紅細胞鉀含量作為耐熱評定指標(biāo)，從高產(chǎn)奶牛群中篩選出耐熱性狀差異顯著的10頭高產(chǎn)荷斯坦牛作為試驗材料，采用隨機擴增多態(tài)性（RAPD）分子標(biāo)記篩選方法，初步篩選出3個耐熱分子遺傳標(biāo)記S441、S463和S93[35]。在該團隊的后續(xù)研究中，又檢測分析了湖南省213頭種母牛和湖南省種公牛站以及北京、上海、南京、安徽等地46頭種公牛，認為S441基因可以作為抗熱應(yīng)激候選基因[36]。謝江昂利用隨機擴增多態(tài)性（PAPD）方法對篩選出的抗熱應(yīng)激分子標(biāo)記進行序列分析，然后做序列特征化擴增區(qū)域（SCAR）轉(zhuǎn)換，并對58頭奶牛進行了檢測，篩選出23頭具有抗熱應(yīng)激分子標(biāo)記的奶牛，發(fā)現(xiàn)有S441標(biāo)記的奶牛對溫?zé)岘h(huán)境的適應(yīng)能力明顯好于無S441標(biāo)記的奶牛，認為S441分子標(biāo)記對奶?？篃釕?yīng)激新品種的選育具有重要的參考價值[37]。胡雄貴等隨機選取52頭高產(chǎn)耐熱荷斯坦牛（7～9月份產(chǎn)奶量平均下降率低于15%，紅細胞鉀含量低于468mg/L）和41頭高產(chǎn)不耐熱荷斯坦牛（7～9月份產(chǎn)奶量平均下降率超過36%，紅細胞鉀含量大于539mg/L），發(fā)現(xiàn)有無S441標(biāo)記的母牛產(chǎn)奶量差異不顯著，但在熱應(yīng)激條件下產(chǎn)奶量下降率差異極顯著[38]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，S441分子標(biāo)記與抗熱應(yīng)激能力相關(guān)的各項生理生化指標(biāo)均具有較強的相關(guān)性，證明S441可以作為一種奶?？篃釕?yīng)激分子標(biāo)記應(yīng)用于品種選育和生產(chǎn)中[39]。劉彥等以S463為奶牛假定抗熱應(yīng)激的RAPD分子標(biāo)記，在核心母牛場湖南省奶牛原種場測定不同世代的種母牛213頭，在湖南省種公牛站以及北京、上海、南京、安徽等地測定種公牛46頭，共檢測出具有S463分子標(biāo)記的母牛26頭，公牛10頭。發(fā)現(xiàn)有S463分子標(biāo)記的奶牛在熱應(yīng)激期間不僅產(chǎn)奶量高，而且產(chǎn)奶量下降率非常低，認為S463可以作為抗熱應(yīng)激分子標(biāo)記。由此推斷，S441和S463基因抗熱應(yīng)激分子標(biāo)記在耐熱牛群中具有特異性[40,41]。

2.3.3 S2011和S275基因

張健選取耐熱性能差異明顯的荷斯坦牛，利用RAPD技術(shù)篩選出與耐熱性能有關(guān)的分子標(biāo)記，并結(jié)合奶牛的生理生化指標(biāo)進行分析，推測引物S2011和S275可以作為篩選奶牛耐熱性狀的分子標(biāo)記[42]。

2.3.4 HSF1 基因

李秋玲等[43]分析了638頭中國荷斯坦牛HSF基因多態(tài)性與耐熱性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛HSF1基因microRNA表達量與熱應(yīng)激反應(yīng)存在顯著相關(guān)，認為HSF1基因可作為選育高耐熱性奶牛的新遺傳標(biāo)記應(yīng)用于育種實踐[44]。

2.3.5 ATP1A1和ATP1B2基因

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王根林研究團隊和山東農(nóng)科院仲躋峰團隊分別研究了中國荷斯坦牛ATP1A1和ATP1B2基因多態(tài)性與耐熱性的關(guān)系及基因表達量，確認這兩個基因可作為奶牛耐熱性狀的候選基因[45～47]。

2．4 通過全基因組檢測分析篩選奶牛抗熱應(yīng)激分子標(biāo)記

陸誠以30頭中國荷斯坦牛和25頭含25%以色列荷斯坦牛血統(tǒng)的雜交牛作為研究對象，采用Affymetix公司的基因表達譜芯片篩選了一批熱應(yīng)激相關(guān)基因，多組共有的表達量變化2倍以上的基因總共257個，其中基因表達上調(diào)139個，基因表達下調(diào)118個[48]。

美國弗羅里達大學(xué)Peter團隊研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激條件下，奶牛的直腸溫度高于39℃、呼吸頻率大于60次/min時，奶牛的產(chǎn)奶和繁殖性能會受到影響[49]。通過監(jiān)測在夏季熱應(yīng)激情況下奶牛的直腸溫度、呼吸頻率和出汗速度等與熱應(yīng)激密切相關(guān)的生理指標(biāo)，利用包含了39 759個SNP位點的Illumina Bovine SNP50芯片對220頭公牛的4 447頭女兒進行全基因組檢測分析，篩選了一批有潛力的熱應(yīng)激基因位點（表1）[7,8]。

表1 荷斯坦牛GWAS分析具有抗熱應(yīng)激生理特征（以直腸溫度39℃為基準）最顯著的20個基因位點

3 國外在抗熱應(yīng)激性能奶牛選育上的新發(fā)現(xiàn)

Olson等[50]研究了委內(nèi)瑞拉的Carora牛發(fā)現(xiàn)攜帶少毛基因的個體夏季直腸溫度較低，耐熱性較強，Carora牛與荷斯坦牛的雜交后代耐熱性增強，他們認為光滑短毛的控制HCT基因可以作為選育抗熱應(yīng)激奶牛的一個遺傳標(biāo)記。美國弗羅里達大學(xué)Peter團隊[7,51]和新西蘭家畜遺傳改良公司（LIC）的Stephen團隊研究發(fā)現(xiàn)[52]，毛發(fā)光滑的奶牛比不光滑的奶?？篃釕?yīng)激性能更強，在夏季熱應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)奶性能受損較輕，提出引起毛發(fā)光滑和長短的突變基因PRL基因及其受體PRLR基因可以作為選育抗熱應(yīng)激奶牛的關(guān)鍵遺傳標(biāo)記。

4 結(jié)語

奶牛耐熱育種工作已經(jīng)進入了新的歷史階段，除了一些基礎(chǔ)性工作，還加強了分子標(biāo)記輔助選擇的耐熱育種科研工作，為縮短世代間隔、提高育種效率提供了依據(jù)[53]。同時力圖借助基因組檢測手段快速篩選出一批具有抗熱應(yīng)激性能的基因位點，以期能有效應(yīng)用于耐熱品種（品系）的選育實踐。