江虹，龐向東，吳小燕，程丹，李娜

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)江師范學(xué)院武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，408100)

食品中的藥殘分析，對(duì)保障人體健康、及時(shí)采取防病防毒措施具有重意義。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在176 號(hào)公告中規(guī)定，嚴(yán)禁在動(dòng)物飼料和飲用水中添加鎮(zhèn)靜、抗驚厥藥物，在動(dòng)物源食品中也不得檢出此類藥物[1]?？R西平屬二苯并氮雜類抗癲癇、鎮(zhèn)痛藥物，具有抑制神經(jīng)興奮、減少機(jī)體運(yùn)動(dòng)和安眠鎮(zhèn)靜等作用。當(dāng)用藥過量時(shí)，年老者可引起精神錯(cuò)亂、激動(dòng)不安、焦慮、房室傳導(dǎo)阻滯或心動(dòng)過緩等(卡馬西平使用說明書中特別強(qiáng)調(diào))；由于卡馬西平能透過胎盤屏障，通過乳汁進(jìn)行分泌，因此對(duì)妊娠孕婦及哺乳期婦女均有影響。畜牧業(yè)中，為了對(duì)所飼養(yǎng)的畜禽達(dá)到快速增重、催肥、謀取更多經(jīng)濟(jì)利益的目的，飼養(yǎng)過程中，有的飼養(yǎng)者擅自在動(dòng)物飼料或飲水中加入了卡馬西平等鎮(zhèn)靜藥物，導(dǎo)致此類藥物在動(dòng)物源食品中的殘留，從而對(duì)消費(fèi)者人體健康造成一定危害。由此可見，對(duì)動(dòng)物源性食品中殘留的卡馬西平進(jìn)行研究具有一定的必要性和重要性。目前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定卡馬西平的方法主要有高效液相色譜法[2-8],液質(zhì)聯(lián)用[9-11],熒光法[12-13],分光光度法[14-15],電化學(xué)法[16-17]等。這些方法中，有的所用儀器價(jià)格較貴，不易普及，有的選擇性不好或靈敏度不高，有的條件要求苛刻等。本工作是在用吸收光譜法研究卡馬西平之后，發(fā)現(xiàn)用共振光散射(resonance light scattering,RLS)技術(shù)研究肉食品中殘留的卡馬西平，有更高的靈敏度，比吸收光譜法約高4～5個(gè)數(shù)量級(jí)，并且有很好的選擇性。該方法用于肉食中殘留卡馬西平的測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡馬西平(CMA)(99.7%，對(duì)照品批號(hào)：100142-201105)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；考馬斯亮藍(lán)(CMS)(分析純)，臨海市億達(dá)貿(mào)易有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris，99.9%)，齊一生物科技(上海)有限公司；溴代十六烷基吡啶(CPB，99%)，武漢易泰科技有限公司上海分公司；豬肉(1#～2#)、雞肉(3#～4#)， 市售；水，二次蒸留水。

卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取CMA對(duì)照品適量，加少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容，配成236.3 mg/L貯備液，冰箱4 ℃ 保存；臨用時(shí)取貯備液稀釋100倍?？捡R斯亮藍(lán)溶液：1.00×10-4mol/L。溴代十六烷基吡啶溶液：稱取適量的CPB，加少量無水乙醇溶解后用水稀釋配成5.00×102mg/L。pH 3.0～8.5 Tris-鹽酸溶液：適量0.10 mol/L鹽酸與適量0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計(jì)測(cè)定而配成。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2500型熒光光度計(jì)，日本日立公司；pHS-3C 型精密酸度計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 樣品處理

取生鮮豬肉和雞肉洗凈、切條并攪成肉末。準(zhǔn)確稱取各樣品15 g左右(精確至0.000 1 g)，置于離心試管中，加甲醇10 mL，攪勻，超聲提取40 min，再離心分離(4 000 r/min)20 min，分出上清液。按上述操作再重復(fù)提取1次。2次上清液合并后，加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，再離心分離(4 000 r/min)30 min，上清液轉(zhuǎn)入一小燒杯中，在通風(fēng)櫥內(nèi)100 ℃恒溫水浴濃縮至約3 mL即為待測(cè)樣品溶液(各平行處理5份)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL具塞比色管中，順序加入適量2.363 mg/L CMA標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L CMS溶液、0.30 mL 5.00×102mg/L CPB溶液和 0.50 mL pH 3.46 Tris-鹽酸溶液，用二次蒸餾水定容、搖勻，15 min后，于熒光儀上(設(shè)λex=λem=220 nm，測(cè)定狹縫5 nm)同步掃描RLS光譜，記錄344 nm波長(zhǎng)處體系和試劑空白的RLS強(qiáng)度IRLS及I0，并計(jì)算他們的強(qiáng)度差值ΔIRLS=IRLS-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1 CMA-CPB-CMS的RLS光譜

按1.4的方法掃描體系各不同組合的RLS光譜，見圖1。

1-0.236 mg/L CMA；2-2.50×10-5 mol/L CMS；3-15.0 mg/L CPB；4-2.50 ×10-5 mol/L CMS,pH 3.46；5-15.0 mg/L CPB,pH 3.46；6-0.236 mg/L CMA-2.50×10-5 mol/L CMS,pH 3.46；7～12-0.0、0.047 3、0.094 5、0.142、0.189、0.236 mg/L CMA-2.50×10-5 mol/L CMS-15.0 mg/L CPB,pH 3.46圖1 CMA-CMS-CPB 的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of CMA-CMS-CPB

從曲線1～6可知，單獨(dú)的CMA、CMS、CPB溶液的RLS信號(hào)十分微弱，CMS的酸性溶液(pH 3.46)、CPB的酸性溶液(pH 3.46)及CMS與CMA在酸性溶液(pH 3.46)中反應(yīng)后的RLS信號(hào)也很微弱。但當(dāng)CMS與CPB在酸性溶液(pH 3.46)中共存時(shí)，RLS信號(hào)有顯著增強(qiáng)，見曲線7，這說明CPB可以增敏CMS；當(dāng)CMA、CMS、及CPB三物質(zhì)在酸性溶液(pH 3.46)中共存時(shí)，體系RLS信號(hào)隨著CMA質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)CMA處于一定濃度范圍內(nèi)，體系的ΔIRLS與CMA的質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，可用于卡馬西平的定量測(cè)定。

可能的反應(yīng)機(jī)理：從CMA、CPB及CMS的分子結(jié)構(gòu)式(圖2)可見，CMA上的氮原子可接受質(zhì)子，以陽離子形式存在于溶液中；CPB分子結(jié)構(gòu)上的Br-離去后以陽離子預(yù)膠束聚集體形式存在于溶液中；CMS分子結(jié)構(gòu)上的Na+離去后以陰離子形式存在于溶液中。

圖2 結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula

帶負(fù)電荷的CMS可聚集在帶正電荷的CPB聚集體的表面，導(dǎo)致RLS信號(hào)急劇增強(qiáng)?？梢?，CMS不僅可與CMA反應(yīng)還可與CPB反應(yīng)，即體系中存在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。他們的可能反應(yīng)為：帶負(fù)電荷的CMS先與帶正電荷的CPB以靜電引力結(jié)合生成帶負(fù)電荷的締合顆粒，再與帶正電荷的CMA結(jié)合(靜電引力)生成電中性的三元離子締合物；或CMS先與CMA以靜電引力結(jié)合生成帶負(fù)電荷的締合顆粒，再與CPB結(jié)合(仍為靜電引力)生成電中性的三元離子締合物。無論以哪種方式結(jié)合，最終生成的三元離子締合物有其較大的摩爾質(zhì)量，導(dǎo)致RLS顯著增強(qiáng)。

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 介質(zhì)及酸度

按1.4的實(shí)驗(yàn)方法分別考察了不同濃度的HCl、NaOH及不同pH的Tris-鹽酸作介質(zhì)時(shí)對(duì)體系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，用pH 3.46 Tris-鹽酸作反應(yīng)介質(zhì)時(shí)體系有較大的ΔIRLS(見圖3誤差線圖)，且有較好的重現(xiàn)性。

圖3 pH值的影響Fig.3 Effect of buffer pH on ΔIRLS

而用不同濃度的鹽酸或NaOH作反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，其體系的IRLS和試劑空白的I0均較小，ΔIRLS

2.2.2 CMS溶液的濃度

按1.4的實(shí)驗(yàn)方法，考察了不同用量的1.00×10-4mol/L CMS溶液對(duì)體系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，CMS溶液的濃度在2.2×10-5～ 2.8×10-5mol/L，體系有較大ΔIRLS(見圖4誤差線圖)。

圖4 考馬斯亮藍(lán)濃度對(duì)體系ΔIRLS的影響Fig.4 Effect of coomassie brilliant blue concentration on ΔIRLS

在此范圍外，ΔIRLS均有不同程度的降低，靈敏度隨之降低。降低原因：當(dāng)CMS的濃度小于2.2×10-5mol/L時(shí)，CMA、CMS及CPB間的反應(yīng)不完全，使ΔIRLS有所降低；當(dāng)CMS的濃度大于2.8×10-5mol/L時(shí)，由于CMS分子間的聚集，使ΔIRLS降低。故實(shí)驗(yàn)選用CMS溶液的濃度為2.50×10-5mol/L(即取2.50 mL 1.00×10-4mol/L CMS溶液于10 mL比色管中)。

2.2.3 表面活性劑及用量

按1.4的實(shí)驗(yàn)方法，考察了陰離子表面活性劑(十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉)、陽離子表面活性劑(溴代十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基銨) 及非離子表面活性劑(Tween-20、Triton X-100) 等對(duì)體系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，在濃度和用量相同的情況下，使用溴代十六烷基吡啶(CPB)作增敏劑有較好的效果，其ΔIRLS相對(duì)較高(ΔIRLS=205)。當(dāng)5.00×102mg/L CPB的用量為0.30 mL時(shí)，體系的RLS信號(hào)相對(duì)最強(qiáng)，此時(shí)的ΔIRLS=225，體系有較高靈敏度，如圖5所示。故實(shí)驗(yàn)用0.30 mL 5.00×102mg/L CPB溶液。

圖5 CPB 溶液用量的影響Fig.5 Effect of CPB solution dosage on ΔIRLS

2.2.4 試劑加入順序

考察了反應(yīng)體系中各試劑加入順序?qū)w系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，試劑加入的最佳順序?yàn)镃MA、CMS、CPB、Tris-鹽酸。按此順序加入時(shí)，體系的RLS信號(hào)相對(duì)最強(qiáng)，ΔIRLS較大，靈敏度較高。故實(shí)驗(yàn)按試劑的最佳加入順序進(jìn)行。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性

按1.4的實(shí)驗(yàn)方法，考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系ΔIRLS的影響，如圖6所示。

圖6 時(shí)間對(duì)ΔIRLS的影響Fig.6 Effect of time on ΔIRLS

結(jié)果顯示，該體系在15 min內(nèi)即可反應(yīng)完全。15 min前，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系的ΔIRLS隨時(shí)間增加而逐漸增大，曲線表現(xiàn)為一條逐漸上升的斜線，由此表明此時(shí)CMA、CMS及CPB間的反應(yīng)并未完全；15 min后，體系的ΔIRLS隨時(shí)間的增加不再增大，即ΔIRLS基本處于同一平臺(tái)上，由此表明此時(shí)CMA、CMS及CPB間的反應(yīng)已進(jìn)行完全。故實(shí)驗(yàn)選在15 min后進(jìn)行測(cè)定，穩(wěn)定時(shí)間的1.5 h。

2.3 工作曲線及相關(guān)參數(shù)

按1.4的實(shí)驗(yàn)方法，配制CMA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，掃描RLS光譜，以ΔIRLS為縱坐標(biāo)，CMA的質(zhì)量濃度ρ(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制344 nm波長(zhǎng)處CMA的工作曲線，見圖7。

圖7 CAM 的工作曲線Fig.7 Working curve of carbamazepine

該工作曲線的線性回歸方程為ΔIRLS=-0.194 2+951.0ρ，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，CMA在0.006～0.33 mg/L與ΔIRLS呈線性關(guān)系，檢出限(3Sb/S)為0.005 6 mg/L，定量限為0.012 mg/kg。

2.4 共存物質(zhì)的影響

考察了相對(duì)誤差≤±5% 時(shí)，某些可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定0.236 mg/L CMA的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，氨基酸、糖類及常見陰、陽離子均不干擾測(cè)定，故該法有很好的選擇性。

表1 共存物質(zhì)的影響Table 1 Effect of coexistent substance

2.5 樣品分析

取1#～4# 待測(cè)液，按1.4實(shí)驗(yàn)方法，以樣液代替標(biāo)液，掃描RLS光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在344 nm處，均未檢出卡馬西平。為了考察該方法的準(zhǔn)確度和精密度，以空白肉樣為樣品，分別進(jìn)行3個(gè)不同加標(biāo)梯度(即不同水平)的回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5份，最后根據(jù)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差判斷該方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

在pH 3.46 Tris-鹽酸及CPB存在下，以CMS作探針測(cè)定肉食品中痕量CMA的RLS法具有高的靈敏度和選擇性、較高的準(zhǔn)確度和精密度及較寬的線性范圍。該法簡(jiǎn)便、快速，操作簡(jiǎn)單，所用儀器為一般的熒光分光光度計(jì)，易于普及。適于肉食品中殘留CMA的測(cè)定。