天母降壓片在小鼠模型中的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用研究

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高血壓是一種病程長(zhǎng)、病情復(fù)雜、伴隨癥狀多的慢性疾病[1-2]。不僅僅是高血壓本身，高血壓所伴隨的并發(fā)癥狀，在疾病過(guò)程中，亦給病人帶來(lái)了不可忽視的負(fù)擔(dān)[3]，伴疼痛[4]、煩躁[5]、焦慮[6]等情緒，常常是高血壓伴隨的主要癥狀，而這些癥狀的改善，在現(xiàn)有的治療中往往被忽略，但它都極大程度地影響著病人的生活質(zhì)量。

根據(jù)中醫(yī)治療高血壓的經(jīng)驗(yàn)，高血壓臨床辨證最多的是陰虛陽(yáng)亢型，常伴有身體多部位疼痛和精神焦慮的癥狀[7-9]。天母降壓片由天麻、珍珠母、鉤藤、菊花、桑葚5 味中藥組成，其中君藥天麻具有平肝潛陽(yáng)、息風(fēng)止痙的功效[10-11]，臨床上常用于肝陽(yáng)上亢之頭痛、眩暈等癥，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)天麻能擴(kuò)張血管，緩解神經(jīng)肌肉的緊張；臣藥珍珠母亦具有平肝潛陽(yáng)之功，與天麻相配合，能增強(qiáng)降壓功效，提高對(duì)高血壓病相關(guān)癥狀的治療效果[12]；方中鉤藤、菊花等其他成分的有關(guān)臨床和基礎(chǔ)研究報(bào)道中亦發(fā)現(xiàn)有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用[13-14]。然而，關(guān)于天母降壓片全方鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用的有關(guān)研究報(bào)道較少。本研究擬通過(guò)醋酸扭體實(shí)驗(yàn)、熱板法實(shí)驗(yàn)、熱刺痛實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)天母降壓片的鎮(zhèn)痛作用；通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)天母降壓片的鎮(zhèn)靜作用。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 天母降壓片粉末[華潤(rùn)三九(棗莊)藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：201606]；阿司匹林腸溶片(德國(guó)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：BJ19030)；地西泮片(山東信誼制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：160601)；醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器 智能熱板儀：RB-200，成都泰盟軟件有限公司；熱刺痛儀：PL-200，成都泰盟軟件有限公司；懸尾儀，TST-100，成都泰盟軟件有限公司。

1.3 動(dòng)物 ICR雄性小鼠，SPF級(jí)，體重18～22 g，共170只，合格證號(hào)11400700232729，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011。

1.4 醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物分5組：模型組(M組， 生理鹽水，8只)；阿司匹林腸溶片組[A組，45 mg/(kg·d)，8只]；天母降壓片低劑量組[TL組，0.27 g/(kg·d)，8只]；天母降壓片中劑量組[TM組，0.54 g/(kg·d)，8只]；天母降壓片高劑量組[TH組，1.08 g/(kg·d)，8只]。生理鹽水、阿司匹林腸溶片和天母降壓片均灌胃給藥。小鼠連續(xù)給藥3 d后，于第3 天給藥30 min后，腹腔注射1%醋酸，注射后5 min，觀察小鼠15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，并計(jì)算扭體反應(yīng)的抑制率，評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛效果。

1.5 輻射熱刺激實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于熱刺痛儀的反應(yīng)容器中，待小鼠平靜之后，將紅外燈對(duì)準(zhǔn)小鼠的尾部或者后掌部，小鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)后，記錄從照射開(kāi)始到甩尾反應(yīng)的潛伏期(tail flick latency， TFL)作為痛閾基礎(chǔ)值(基礎(chǔ)TFL)，同時(shí)剔除反應(yīng)時(shí)間小于2 s或者大于10 s的小鼠。24 h后給藥，小鼠給藥后30 min，將小鼠置于熱刺痛儀的反應(yīng)容器中，待小鼠平靜之后，將紅外燈對(duì)準(zhǔn)小鼠的尾部或者后掌部，小鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)后，記錄從照射開(kāi)始到甩尾反應(yīng)的潛伏期作為給藥后TFL，并計(jì)算小鼠給藥后的痛閾提高率，閾值提高率按照按如下公式計(jì)算，評(píng)價(jià)藥物鎮(zhèn)痛強(qiáng)度。

痛閾提高率(%)=[(給藥后TFL —基礎(chǔ)TFL)/基礎(chǔ)TFL]×100%

1.6 熱板實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，提前將熱板儀的溫度設(shè)定為53 ℃，待溫度恒定后，將小鼠置于熱板儀中，記錄小鼠第一次舔后足時(shí)間及之后60 s內(nèi)的舔足次數(shù)，同時(shí)剔除反應(yīng)潛伏期大于60 s的小鼠。24 h后給藥，小鼠給藥后30 min，將小鼠置于恒溫53 ℃的熱板儀中，記錄第一次舔后足時(shí)間和60 s內(nèi)的舔足次數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 懸尾實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，固定小鼠尾部使其頭向下懸掛，利用圖像跟蹤系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間，作為基礎(chǔ)檢測(cè)值。24 h后給藥，并連續(xù)給藥3 d，于第3天給藥后30 min測(cè)定小鼠的不動(dòng)時(shí)間，固定小鼠尾部使其頭向下懸掛，利用系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間，并對(duì)小鼠的不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)ICR小鼠扭體次數(shù)的影響 小鼠在腹腔注射醋酸后，模型組扭體次數(shù)顯著升高。與模型組相比，阿司匹林腸溶片組對(duì)模型小鼠扭體次數(shù)和扭體次數(shù)的抑制率均有顯著改善(P<0.01)；天母降壓片各劑量組均能顯著降低扭體次數(shù)(P<0.01)，同時(shí)，也能顯著提高醋酸扭體次數(shù)的抑制率(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1、圖2。

與M組相比，*P<0.01

與M組相比，*P<0.01

2.2 對(duì)ICR小鼠甩尾反應(yīng)潛伏期的影響 與模型組相比，陽(yáng)性藥阿司匹林能顯著提升ICR小鼠甩尾反應(yīng)的潛伏期(P<0.01)，提升小鼠的痛閾值(P<0.01)；天母降壓片各劑量組均能顯著提高小鼠的甩尾反應(yīng)潛伏期(P<0.01)，提升小鼠的痛閾值(P<0.01)。詳見(jiàn)圖3、圖4。

與M組相比，*P<0.01

與M組相比，*P<0.01

圖4天母降壓片對(duì)小鼠痛閾提高率的影響

2.3 對(duì)ICR小鼠舔足時(shí)間、舔足次數(shù)的影響 與模型組小鼠相比，陽(yáng)性藥阿司匹林腸溶片可延長(zhǎng)組內(nèi)小鼠的第一次舔足時(shí)間(P<0.05)，對(duì)于60 s內(nèi)的舔足次數(shù)，沒(méi)有改善作用；給予天母降壓片各劑量組均能顯著延長(zhǎng)ICR小鼠的第一次舔足時(shí)間(P<0.01)，天母降壓片高劑量組顯著降低小鼠60 s內(nèi)的舔足次數(shù)(P<0.01)，中劑量組能明顯降低小鼠的舔足次數(shù)(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5、圖6。

與M組相比，*P<0.05

圖5天母降壓片對(duì)小鼠第一次舔足時(shí)間的影響

與M組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 對(duì)ICR小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響 與模型組相比，陽(yáng)性藥地西泮片能顯著升高小鼠的不動(dòng)時(shí)間(P<0.01)；天母降壓片各劑量組均能明顯提高小鼠的不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)。詳見(jiàn)圖7。

與M組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

在高血壓的病理進(jìn)程中，疼痛是病人最易感受，但在治療上往往被忽視的一個(gè)伴隨癥狀，很大程度上影響著病人的生活和生存質(zhì)量。疼痛根據(jù)痛覺(jué)感受器發(fā)生部位的不同，可以分為外周性疼痛與中樞性疼痛[15]，具有疼痛緩解作用的藥物也可分為中樞性鎮(zhèn)痛藥和外周性鎮(zhèn)痛藥[16]。本研究主要采用醋酸扭體實(shí)驗(yàn)[17]、熱輻射甩尾實(shí)驗(yàn)[18]、熱板實(shí)驗(yàn)[19]3方法，檢測(cè)天母降壓片的鎮(zhèn)痛作用效果及作用機(jī)制。

醋酸扭體實(shí)驗(yàn)因?yàn)槠浞椒ê?jiǎn)便、靈敏、重現(xiàn)性好，并且沒(méi)有明顯的中樞性或外周性篩選區(qū)分的特點(diǎn)，常被用作鎮(zhèn)痛藥物的初篩研究中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天母降壓片各劑量組均具有較好的鎮(zhèn)痛作用。

為了進(jìn)一步確定天母降壓片的鎮(zhèn)痛機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行熱輻射實(shí)驗(yàn)和熱板實(shí)驗(yàn)。熱輻射甩尾實(shí)驗(yàn)是一種將強(qiáng)光照射到動(dòng)物尾部，一段時(shí)間后，動(dòng)物因熱刺痛而產(chǎn)生逃跑反應(yīng)或者避害甩尾反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法。因?yàn)樘优芊磻?yīng)是由大腦所控制的復(fù)雜生物現(xiàn)象，甩尾是脊柱反射調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，所以，熱輻射甩尾實(shí)驗(yàn)常被用作評(píng)價(jià)效價(jià)較強(qiáng)，并且作用機(jī)制可能涉及中樞鎮(zhèn)痛的鎮(zhèn)痛藥物藥效評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天母降壓片各組能夠顯著提高動(dòng)物的痛閾值，并且可能是由于其對(duì)神經(jīng)中樞突觸信號(hào)的阻斷而使動(dòng)物痛閾值升高所導(dǎo)致的。同時(shí)，熱板實(shí)驗(yàn)也對(duì)天母降壓片可能作用于中樞鎮(zhèn)痛給予驗(yàn)證。熱板實(shí)驗(yàn)是一種將動(dòng)物放置于熱板上，動(dòng)物在一段時(shí)間后會(huì)舔足以降溫的實(shí)驗(yàn)方法。在該實(shí)驗(yàn)中，將動(dòng)物放置于熱板上到動(dòng)物出現(xiàn)第一次舔足的動(dòng)作時(shí)間間隔，被定義為痛閾；而在規(guī)定時(shí)間內(nèi)舔足次數(shù)的多少，反應(yīng)動(dòng)物對(duì)熱板刺激所帶來(lái)疼痛的敏感程度。因?yàn)樘蜃惴磻?yīng)需要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物的行為做出協(xié)調(diào)性的指示，所以這一模型常用作效價(jià)較強(qiáng)的中樞鎮(zhèn)痛藥物的評(píng)價(jià)研究中。本實(shí)驗(yàn)中，天母降壓片各劑量組能顯著增加第一次舔足時(shí)間，提高動(dòng)物的痛閾值；天母降壓片各劑量組能明顯提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)熱刺激的耐受程度。其作用機(jī)制與天母降壓片的中樞鎮(zhèn)痛作用有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用懸尾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)天母降壓片的鎮(zhèn)靜作用。在連續(xù)給藥3 d后，天母降壓片可顯著延長(zhǎng)不動(dòng)時(shí)間，增加不動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)時(shí)間，提示天母降壓片能夠?qū)Ω哐獕翰±磉M(jìn)程中的煩躁現(xiàn)象有一定程度的改善作用。

天母降壓片具有較為顯著的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，提示天母降壓片能在降壓的同時(shí)，通過(guò)改善病人的疼痛和精神狀態(tài)，起到對(duì)高血壓的綜合治療作用。