尤俊昊，黃曉華，趙愛(ài)國(guó)

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林業(yè)科學(xué)研究院，陜西 楊凌 712100)

我國(guó)是世界上漆樹(shù)資源最豐富的國(guó)家,在我國(guó)大部分省(區(qū))均有分布。生漆是漆樹(shù)次生代謝產(chǎn)物，是從漆樹(shù)中分泌出的一種灰白色濁液，為優(yōu)良的天然涂料，具有抗腐蝕、防潮、耐高溫、防水等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)已有6 900多年的應(yīng)用歷史[1-2]，長(zhǎng)久以來(lái)享有“涂料之王”的美譽(yù)[3]。生漆主要由漆酚、漆酶、樹(shù)膠質(zhì)和水組成，其中催化生漆干燥成膜的重要物質(zhì)是生漆中所含的漆酶[4]，漆樹(shù)漆酶是生漆的重要組成部分，漆樹(shù)漆酶是催化漆酚聚合成膜的主要成分，在生漆精制及改性過(guò)程中漆樹(shù)漆酶容易失去活性。因此，對(duì)漆樹(shù)漆酶進(jìn)行分離提取，并確定其性質(zhì)，不僅對(duì)漆樹(shù)漆酶的研究、開(kāi)發(fā)、利用具有重要的意義，而且對(duì)生漆改性精制也有非常重要的意義。

對(duì)漆酶的研究已有100多年的歷史,是有記載以來(lái)開(kāi)發(fā)最早的酶之一。1883年,漆樹(shù)漆酶最早由日本人吉田從日本漆樹(shù)(Toxicodendronvernicifluum)的汁液中分離，當(dāng)時(shí)被誤為淀粉酶物質(zhì)[5]。1898年，法國(guó)人Bertrand對(duì)這種淀粉酶類物質(zhì)的催化活性進(jìn)行了分析，并重新命名為漆酶(Laccase)[5]。Reinhammar等和杜予民等對(duì)漆酶及漆樹(shù)液全成分的分離純化作了很好的工作;另外,熊野等對(duì)漆酶反應(yīng)機(jī)理,黃葆同和甘景鎬等對(duì)中國(guó)漆酶化學(xué)的發(fā)展, Morpurgo等對(duì)漆酶銅原子中心的研究作出了各自的貢獻(xiàn)[6]。漆酶(EC1.10.3.2)，全稱為對(duì)-二酚∶(雙)氧氧化還原酶，又稱為酚酶、漆酚氧化酶等，是一種含銅的糖蛋白氧化酶，能催化酚、硫酚和芳胺等物質(zhì)的氧化反應(yīng)，屬于銅藍(lán)氧化酶蛋白家族的一員[7]。

漆酶在真菌、植物、原核生物中均有發(fā)現(xiàn)。它能催化多酚、多胺基苯等底物氧化。多年來(lái), 漆酶的研究經(jīng)久不衰, 它涉及生物、化學(xué)、環(huán)境等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域, 一直引起人們的廣泛關(guān)注和極大興趣[8-14]。漆酶對(duì)漆酚的聚合、紙漿去木質(zhì)素、高等植物病菌防御等過(guò)程也起著重要的作用，近年來(lái)已經(jīng)廣泛用于藥物分析、乙醇生產(chǎn)和酒類去酚、生物整治(包括染料脫色、工業(yè)廢水處理和殺蟲劑的降解)等領(lǐng)域[3,15]。漆酶酶活的測(cè)定方法很多，有分光光度法、測(cè)O2法、高效液相色譜法、極譜法、脈沖激光光聲分析法、微量熱法等[16]。由于漆酶的來(lái)源很多，而不同來(lái)源的漆酶與底物反應(yīng)的親和力是不一樣的，即使是同一來(lái)源的漆酶，反應(yīng)的底物不同，反應(yīng)的親和力也不同，測(cè)得的酶活數(shù)值也不同。所以，至今還沒(méi)一種標(biāo)準(zhǔn)的、統(tǒng)一的酶活測(cè)定方法。漆樹(shù)漆酶反應(yīng)條件溫和、具有很寬的底物選擇性[17-18]。如今，ABTS法是目前研究中最常用的漆酶酶活測(cè)定方法之一，本研究涉及了溫度、pH、金屬離子種類及濃度對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響，以確定ABTS法測(cè)定靈芝漆酶酶活的最適條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

精濾生漆(標(biāo)準(zhǔn)生漆)，陜西卓萌商貿(mào)有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑與儀器

2,2′-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(簡(jiǎn)稱ABTS)為美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品，檸檬酸、磷酸氫二鈉、硫酸銨、硝酸鈣、七水合硫酸鋅、五水合硫酸銅、六水合三氯化鐵、氯化鉀、硫酸鎳等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

主要儀器有：尤尼柯(上海)UV2600A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；北京科偉永興儀器HH-1型電熱恒溫水浴鍋；上海亞榮生化SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵；湖南湘儀離心機(jī)；北京君意電泳儀；上海良平FA1004電子天平。

1.3 漆樹(shù)漆酶的提取分離

漆樹(shù)漆酶粗提：將500 g生漆原料倒于2 000 ml大燒杯中，加2～3倍冷丙酮攪拌置于0 ℃左右環(huán)境靜置4 h。靜置分層，將上層清液倒出，下層沉降進(jìn)行負(fù)壓抽濾，用冷丙酮沖洗沉淀至濾液無(wú)色,然后收集沉淀即得丙酮粉末粗漆酶，將其置于通風(fēng)櫥風(fēng)干。將所得風(fēng)干好的濾餅粉末倒入提前準(zhǔn)備好的500 ml溶液中進(jìn)行磁力攪拌2～3 h。將攪拌后的液體進(jìn)行離心操作，再進(jìn)行負(fù)壓抽濾，所得濾餅顏色呈藍(lán)灰色。

漆樹(shù)漆酶精提：將提取的粗漆酶溶解在一定量的含10%(NH4)2SO4的pH為6.8濃度為50 mmol·L-1的Tris-HCL緩沖溶液中進(jìn)行沉淀操作，鹽沉后現(xiàn)象并不明顯。再向?yàn)V液中加入丙酮，靜置后分層，上層為絮狀物，將上層分離，下層溶液再次負(fù)壓抽濾，將抽濾后的濾液裝入離心管內(nèi)再次離心，得到淺藍(lán)色濾液，漆樹(shù)漆酶精提成功。

1.4 漆樹(shù)漆酶測(cè)定方法

ABTS法測(cè)定漆酶酶活：向試管中加入1 ml緩沖溶液，0.5 ml的0.25 mmol·L-1的ABTS，搖勻，加入5 μl稀釋了適當(dāng)倍數(shù)的漆樹(shù)漆酶溶液，測(cè)定420 nm處6 min時(shí)的吸光值。每個(gè)測(cè)定條件設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果數(shù)據(jù)為平均值。

漆樹(shù)漆酶酶活定義：每分鐘氧化1 μmol底物所需要的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

漆樹(shù)漆酶酶活計(jì)算公式：

式中ε為ABTS吸光系數(shù)360 000 L(mol·cm)-1，V總代表漆樹(shù)漆酶酶活測(cè)定反應(yīng)體體系中的體積，V酶代表反應(yīng)添加的酶液體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆樹(shù)漆酶提取結(jié)果

將提取到的漆酶進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示，左邊兩條為漆樹(shù)漆酶蛋白條帶，最右側(cè)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker蛋白條帶。如圖結(jié)果所示，漆樹(shù)漆酶顯示一條明顯的蛋白條帶，比對(duì)漆樹(shù)漆酶蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker在電泳凝膠上的相對(duì)遷移率，得知該漆樹(shù)漆酶蛋白條帶相對(duì)寬廣，其分子量約為100 KDa左右。根據(jù)漆樹(shù)漆酶氨基酸序列預(yù)測(cè)，去掉信號(hào)肽，其分子量約為55 KDa，但由于漆酶有翻譯后糖基化修飾，漆樹(shù)漆酶中含糖量高達(dá)45%，故漆酶成熟蛋白分子量要大于根據(jù)氨基酸序列預(yù)測(cè)所得分子量，此結(jié)果與所報(bào)道的大多數(shù)的漆樹(shù)漆酶的分子量大致相同[19]。

圖1 漆樹(shù)漆酶蛋白凝膠電泳圖

2.2 pH對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

分別以pH2.2的氯化鉀-鹽酸緩沖液和pH2.6～5.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配制漆樹(shù)漆酶反應(yīng)液于室溫(25 ℃)反應(yīng)6 min后測(cè)定漆酶酶活，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

由圖2結(jié)果表明：不同pH的緩沖溶液對(duì)漆樹(shù)漆酶活性有著不同的影響，在pH為3左右范圍內(nèi)漆樹(shù)漆酶活性較高，其中pH為2.6時(shí)漆酶活性最高，漆樹(shù)漆酶活力為641.67 U·L-1。在pH大約為4以后，漆酶活性較低，緩沖溶液對(duì)漆酶活性影響較不明顯。

2.3 溫度對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

將pH為2.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配置漆樹(shù)漆酶反應(yīng)液于25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃保溫反應(yīng)6 min后測(cè)定漆酶酶活。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

由圖3結(jié)果表明：漆樹(shù)漆酶的活性在35 ℃時(shí)最高，即漆樹(shù)漆酶的最適溫度為35 ℃，漆酶活力為720.833 U·L-1。當(dāng)溫度從25 ℃到35 ℃過(guò)程中，漆樹(shù)漆酶的活性隨溫度的升高而增加，35 ℃時(shí)達(dá)到峰值，漆樹(shù)漆酶活性最大。當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)漆樹(shù)漆酶的活性整體呈下降趨勢(shì)，45～55 ℃之間漆樹(shù)漆酶活性趨于平穩(wěn)，變化不明顯，當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)漆酶活性急劇下降。由此表明影響漆樹(shù)漆酶的最適溫度為35 ℃，這與張飛龍[20]所報(bào)道的漆樹(shù)漆酶最適溫度相一致。

2.3 金屬離子對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

將pH為2.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配置漆樹(shù)漆酶添加金屬離子溶液置于35 ℃保溫反應(yīng)6 min后測(cè)定漆酶酶活。

分別配制金屬離子終濃度為0、3、5、7、10、50、100 mmol·L-1的含有銅和金屬離子終濃度為0、5、10、50、100、200、300 mmol·L-1的鎳金屬離子的漆樹(shù)漆酶溶液來(lái)測(cè)定銅、鎳金屬離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活影響。其中結(jié)果(圖4和圖5)表明，銅、鎳兩種金屬離子在低濃度(即0～10 mmol·L-1)時(shí)對(duì)漆樹(shù)漆酶活性有激活作用，大致在0～10 mmol·L-1起強(qiáng)激活作用，其中銅離子激活作用最強(qiáng)，這與報(bào)道的漆酶是一種含銅的多酚氧化酶相一致(Palmieri G et al. 1999)。隨后激活作用下降；在高濃度時(shí)(10 mmol·L-1后)對(duì)漆樹(shù)漆酶活性起抑制作用。且在10 mmol·L-1后金屬離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活的抑制近似趨于飽和狀態(tài)，即金屬離子濃度對(duì)漆樹(shù)漆酶活性影響不再突出。

圖4 Cu2+對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

圖5 Ni2+對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

配制金屬離子終濃度為0、5、7、9、10、12 mmol·L-1的含有三價(jià)鐵金屬離子的漆樹(shù)漆酶溶液來(lái)測(cè)定Fe3+對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活影響。其中結(jié)果(圖6)表明，F(xiàn)e3+在低濃度時(shí)就對(duì)漆樹(shù)漆酶活性有強(qiáng)抑制作用，這與所報(bào)道中漆酶受Fe3+強(qiáng)抑制作用相一致(王國(guó)棟等 2003)。大致在0～10 mmol·L-1起強(qiáng)抑制作用；在較高濃度(10 mmol·L-1后)對(duì)漆樹(shù)漆酶活性抑制作用近似飽和，漆樹(shù)漆酶活性趨近于0。

圖6 Fe3+對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

分別配制金屬離子終濃度為0、3、5、7、10、50、100 mmol·L-1的含有鈣、鋅、鉀三種金屬離子的漆樹(shù)漆酶溶液來(lái)測(cè)定三種金屬離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活影響。其中結(jié)果(圖7-9)表明，三種金屬離子在低濃度時(shí)對(duì)漆樹(shù)漆酶活性影響不大，大致在0～10 mmol·L-1起微弱的激活作用；在高濃度時(shí)(10mmol·L-1后)對(duì)漆樹(shù)漆酶活性起抑制作用。且均在10 mmol·L-1后金屬離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活的抑制近似趨于飽和狀態(tài)，即金屬離子濃度對(duì)漆樹(shù)漆酶活性影響不再突出。

圖7 Ca2+對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

圖8 Zn2+對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

圖9 K+對(duì)漆樹(shù)漆酶活性的影響

3 結(jié)論

(1)以生漆為原料，通過(guò)冷丙酮和硫酸銨提取成功獲得漆樹(shù)漆酶溶液，經(jīng)凝膠電泳測(cè)得漆樹(shù)漆酶蛋白大小約在100 KDa左右，根據(jù)漆樹(shù)漆酶氨基酸序列預(yù)測(cè)，去掉信號(hào)肽，其分子量約為55 KDa，經(jīng)BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得所提取漆樹(shù)漆酶蛋白溶液濃度為386.933 μg·L-1。

(2)當(dāng)pH為2.6時(shí)漆樹(shù)漆酶活性最高，漆樹(shù)漆酶活力為641.67 U·L-1。在pH大約為4以后緩沖溶液對(duì)漆酶活性影響較不明顯。在pH為2.6條件下漆樹(shù)漆酶的的最適溫度為35 ℃，漆酶活力為720.833 U·L-1。

(3)在低濃度時(shí)，銅、鎳離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活起激活作用，其中銅離子激活作用最強(qiáng)；三價(jià)鐵離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活起強(qiáng)抑制作用；鈣、鋅、鉀離子對(duì)漆樹(shù)漆酶酶活影響不顯著；在高濃度時(shí)，各金屬離子均不同程度抑制漆酶酶活，對(duì)漆樹(shù)漆酶活性抑制作用近似飽和，金屬離子濃度對(duì)漆樹(shù)漆酶活性影響不再突出。