李峰 包海鷹

摘 要 目的：探討人參根總皂苷（GRS）對對乙酰氨基酚（APAP）誘導的急性肝損傷小鼠的保護作用。方法：建立APAP誘導小鼠急性肝損傷模型，設空白對照組， 模型對照組及GRS高、中、低劑量組，通過檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及肝臟勻漿中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，并結合肝組織病理切片進行分析。結果：人參根皂苷各劑量組對APAP誘導的急性肝損傷小鼠均有保護作用，其中高劑量組最好。結論：其保護作用的機制可能與炎癥、氧化應激及改善肝功能三個方面有關。

關鍵詞 人參根總皂苷 對乙酰氨基酚 肝損傷

中圖分類號：R282.71； R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）03-0055-05

Protective effects of ginseng root saponins on acute liver injury induced by APAP in mice*

LI Feng**， BAO Haiying***

（College of Chinese Medical Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the protective effects of ginseng root saponins on APAP-induced acute liver injury in mice. Methods： A mouse model of acute liver injury induced by APAP was established using acetaminophen. The mice were randomly assigned as a control group， a model group and GRS high， middle and low dose groups. The levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， alkaline phosphatase （ALP）， interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor a （TNF-α） in serum and malondialdehyde （MDA）， reduced glutathione （GSH）， and superoxide dismutase （SOD） in liver homogenate were determined and analyzed by combined with histopathological biopsy. Results： Ginseng root saponins have protective effects on APAP-induced acute liver injury in mice， in which the best results occurred in the high-dose group. Conclusion： Its protective mechanism may be related to three aspects including inflammation， oxidative stress and the improvement of liver function.

KEy WORDS ginseng root saponins； acetaminophen； liver injury

人參（Panax ginseng C. A. Mey）作為傳統(tǒng)中藥，其化學成分和藥理活性方面的研究一直是中藥領域的關注熱點。人參化學成分復雜，目前人參中已經(jīng)分離鑒定40余種人參皂苷單體，其次還含有人參多糖、氨基酸、蛋白質、人參二醇、人參三醇等有效成分。其中人參皂苷為主要活性成分之一，具有保護心功能，降血糖，抗氧化，抗疲勞，抗腫瘤等藥理活性作用[1]。近年來的研究表明，人參皂苷在肝臟疾病如肝癌、肝纖維化、肝損傷和肝炎等，以及肝移植與肝臟切除中已經(jīng)顯現(xiàn)出一定的治療作用。根據(jù)文獻報道，人參皂苷在肝臟疾病中的作用機制較為復雜，主要是通過抗氧化、抗炎等作用來保護肝細胞和調節(jié)肝功能[2-4]。但在日常生活中，我們治療肝臟疾病時，常常用護肝類等西藥，雖然有療效好，見效快等優(yōu)點，但是長時間服用會帶來抗藥性和不良反應，而植物藥的開發(fā)利用，具有整體和多靶點治療作用，很少有不良反應和耐藥性。因此植物藥的開發(fā)利用趨勢已經(jīng)成為研究熱點。

對乙酰氨基酚（APAP）是最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，在治療劑量時療效顯著，用藥安全。但是在過量或其他特殊情況下APAP會給機體帶來嚴重肝損傷的危險，甚至死亡，例如肝壞死、肝病變和肝硬化等肝臟方面的疾病。APAP使用過量所誘導的急性肝損傷導致美國每年近500人死亡，住院人數(shù)更多[5-6]；我國對此也引起高度重視。本文主要從抗炎、抗氧化、改善肝功能等方面闡述人參根總皂苷對APAP誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用，以便為植物藥的開發(fā)利用提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR雄性小鼠，SPF級，體重20.0～22.0 g。由長春生物制品研究所有限責任公司提供，許可批號：SCXK-（吉）2016-0008，實驗前以常規(guī)方式進行適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品、儀器及試劑

APAP購自吉林省金泰化玻有限公司；人參根總皂苷購自撫松縣安東參業(yè)有限公司。

Shimadzu-AUY220型電子分析天平（日本島津有限公司）；MCD-2000型高速離心機（Hsiangtai公司）；BX61光學顯微鏡（上海比目儀器公司）；石蠟切片機、組織攤片機和組織包埋機（德國Leica公司）；HH-W420型水浴箱（金壇市科析儀器有限公司）。

谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自南京建成科技有限公司；試劑盒白細胞介素1b（IL-1b）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）購自美國R&D;公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理

ICR小鼠，隨機分為5組，每組10只，分別為空白對照組，模型對照組，GRS高劑量組，GRS中劑量組，GRS低劑量組。連續(xù)給藥7 d，同期空白對照組每天灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)給藥7 d后，除空白對照組以外，其余各組給藥1 h后腹腔注射300 mg/kg的APAP。造模期間，禁食，不禁水。造模24 h后取血解剖進行樣本處理。

1.3.2 樣本處理

1）血清樣本 小鼠眼球取血，收集血液后，離心10 min左右（3 000 r/min），將血清和紅細胞迅速分離。

2）肝組織勻漿 切割標本后，稱取重量。保持2～8 ℃的溫度。以1∶9加入生理鹽水，用勻漿器將標本勻漿充分。離心10 min左右（3 000 r/min）。仔細收集上清，置冰箱內(nèi)藏備用。

3）蘇木精-伊紅（HE）染色 觀察各組小鼠肝臟組織病理學改變，小鼠脊椎脫臼處死后，每次每組選取5只小鼠，迅速切取小鼠肝臟，用10%福爾馬林固定24 h，標本按常規(guī)方法進行切片，厚度設為5 mm，經(jīng)HE染色制作腎臟組織石蠟切片。

1.3.3 血清肝功能指標檢測

依照試劑盒說明書按照試劑盒的測定指標，繪制標準曲線，獲取各測定指標濃度，檢測血清ALT、ALP及AST活性。

1.3.4 炎癥因子指標檢測

依照嚴格按照ELISA試劑盒說明書嚴格操作，檢測血清中IL-1b和TNF-a水平。

1.3.5 氧化應激指標檢測

取凍存的肝組織，制備組織勻漿，取上清液，嚴格按照劑盒說明書測定GSH、MDA的含量及SOD活性。

1.3.6 腎臟病理切片檢測

經(jīng)HE染色制作腎臟組織石蠟切片，于光學顯微鏡下觀察腎臟病理學改變。

1.3.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計量組間比較采用單因素方法（ANOVA）進行統(tǒng)計分析；采用GraphPad Prism 6.0軟件進行方差分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 對血清中ALT、AST、ALP的活性影響

與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠的血清ALT、AST和ALP活性顯著升高（P<0.01），說明小鼠急性肝損傷模型制備成功。與模型組小鼠比較，GRS高、中劑量組能顯著降低小鼠血清中ALT、AST、ALP的活性，且存在一定的劑量效應關系（P<0.01），GRS低劑量組能夠明顯降低ALT、AST、ALP的活性（P<0.05），說明人參根總皂苷對APAP誘導的小鼠急性肝損傷具有降酶保肝作用（表1）。

2.2 對肝組織勻漿中MDA、GSH的含量及SOD的活性的影響

與空白組小鼠比較，模型組肝臟中的MDA的含量有顯著升高（P<0.01），GSH的含量及SOD的活性顯著降低（P<0.01）。與模型對照比較，GRS高劑量組能夠顯著使肝臟中MDA含量降低（P<0.01），使GSH的含量和SOD的活性顯著升高（P<0.01）。GRS中劑量組能夠明顯使肝臟中的MDA含量降低（P<0.05），使GSH的含量明顯升高（P<0.05），使SOD的活性顯著升高（P<0.01）。GRS低劑量組能夠使肝臟中的SOD活性明顯升高（P<0.05），肝臟中的MDA及GSH的含量則無統(tǒng)計學意義。以上數(shù)據(jù)說明人參根皂苷能夠提高肝組織抗氧化能力以及減緩APAP對肝細胞產(chǎn)生的脂質過氧化作用（表2）。

2.3 對血清中TNF-α、IL-1β的影響

與空白組小鼠比較，模型組小鼠的血清中TNF-a、IL-1b有顯著升高（P<0.01），與模型組比較，GRS高劑量組TNF-a、IL-1b顯著降低（P<0.01），GRS中、低劑量組TNF-a、IL-1b明顯降低（P<0.05，圖1）。

2.4 小鼠HE染色肝臟病理切片顯微結構

空白對照組肝小葉邊界清晰，肝細胞以中央靜脈為中心，呈明顯放射狀形式排列，細胞形態(tài)良好。模型組組織結構破壞，肝細胞水樣變性，細胞壞死，中央靜脈淤血。有較多炎細胞浸潤。GRS高、中、低劑量組，均在一定程度上可減輕組織病變范圍與程度，使炎細胞浸潤減少，但其效果均不如高劑量組（圖2）。

3 討論

藥物性肝損傷是常見的藥物副作用，當APAP給藥劑量過大時，生成NAPQI過多，引起肝臟GSH耗損[7-8]。除此之外，APAP通過肝臟代謝產(chǎn)生的自由基能引發(fā)肝細胞膜脂質過氧化，但是在肝臟細胞的Ⅱ相代謝中，其包括解毒酶和抗氧化酶，是清除體內(nèi)有害物質的重要途徑[9]。

本研究中，APAP小鼠肝細胞存在一定程度的氧化應激損傷，給藥劑量組能夠顯著降低MDA的濃度，提高GSH的含量，及SOD的活性，表明人參根皂苷能夠提高肝組織抗氧化能力以及減緩APAP對肝細胞產(chǎn)生的脂質過氧化作用。

ALP存在機體的各個組織與器官中，其中以肝臟、骨骼和腎臟含量局多，正常血清中的ALP主要由成骨細胞產(chǎn)生，經(jīng)血液流向肝臟，再從膽道系統(tǒng)排泄，當膽汁淤積性肝炎和肝外梗阻時ALP會明顯升高。當肝臟受到損傷或者發(fā)生障礙時，反流入血也會而引起血清ALP升高[10]。而ALT主要存在于肝細胞漿內(nèi)，當肝細胞受到損傷時，細胞內(nèi)的轉氨酶可會進入到血液中，從而引起血ALT升高。AST、g-GT、LDH也存在于肝細胞漿內(nèi)，AST并分布于線粒體內(nèi)，當肝細胞損害嚴重時，線粒體內(nèi)AST釋放入血，使血清AST升高大于ALT[11]。本研究證實，APAP模型組中，ALT、AST、ALP的水平均升高，而給藥GRS高、中劑量組能夠顯著降低三種酶的水平，改善肝功能，人參根總皂苷對APAP誘導的小鼠急性肝損傷具有降酶保肝作用。

TNF-a在肝臟主要由激活的肝巨噬細胞產(chǎn)生，并作為重要的促炎因子和免疫調節(jié)因子參與各種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展[12]，在人類肝病中起著至關作用。IL-1b是一種重要的炎癥因子，近年來研究發(fā)現(xiàn)，一直在多種臟器損傷中起著重要作用[13]。本研究中，APAP模型組，TNF-a、IL-1b的水平顯著升高，給藥組能夠降低 TNF-a、IL-1b的水平，說明人參根皂苷可以減輕APAP所致的肝損傷。本研究還證實，人參根總皂苷能夠提高急性肝損傷小鼠肝組織抗氧化酶活力，減輕自由基對肝臟造成的的氧化損傷，與模型組比較能夠降低ALT、AST、ALP三種酶的活性并且降低TNF-a、IL-1b炎癥因子濃度。

綜上所述，人參根皂苷對APAP致急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與炎癥、氧化應激及改善肝功能三個方面有關。這為APAP誘導的小鼠急性肝損傷的深入研究及更好的臨床應用提供一定的理論依據(jù)。

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