高斌，熊瑩暉，黃澤炳，胡興旺，范學(xué)工

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 感染病科/病毒性肝炎湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

原發(fā)性肝癌是全球第六大惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)性死亡的第二大原因，其每年造成全球約70萬(wàn)人死亡[1]。在我國(guó)，原發(fā)性肝癌發(fā)病率居第二位，僅次于肺癌[2]，它的病理類(lèi)型主要包括肝細(xì)胞癌（HCC）、肝內(nèi)膽管癌（ICC）和混合型肝癌（HCC-ICC），其中85%～90%為HCC[3]。乙型肝炎病毒（HBV）持續(xù)感染后導(dǎo)致肝硬化進(jìn)而演變成為HCC是其發(fā)病率驟升的主要原因[4]，慢性HBV感染患者發(fā)展成為HCC的風(fēng)險(xiǎn)相較于未感染者增加了近100倍[5]。盡管肝切除和肝移植仍是目前HCC最有效的治療方法，但由于HCC早期癥狀比較隱匿，很多患者一經(jīng)診斷便失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[6]，那么對(duì)于HCC的早期診斷便變得尤為重要。目前臨床上常用甲胎蛋白（AFP）作為HCC的篩查，但因AFP在轉(zhuǎn)錄上受多種因素調(diào)控，約1/3的HCC患者血清AFP正常，因而具有一定局限性[7]。因此，探尋新的HCC早期特異性診斷標(biāo)志物具有重要意義。

外泌體是直徑在40～100 nm之間的具有生物學(xué)功能的細(xì)胞外囊泡，可以由多種類(lèi)型的細(xì)胞所分泌，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肝細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞[8]。它可以存在于各種體液當(dāng)中，如血液、尿液、唾液以及母乳[9]，外泌體中富含大量的脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA（miRNA）以及能夠介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞的活性分子，它可以通過(guò)轉(zhuǎn)移功能蛋白、miRNA和其他活性物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系，廣泛參與細(xì)胞間物質(zhì)交換與信息交流[10]。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以比正常細(xì)胞分泌更多的外泌體，將miRNA和或活性分子傳遞至特定細(xì)胞或組織，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的微環(huán)境，不同程度地參與腫瘤進(jìn)展的病理過(guò)程[11]。miRNA是一種小的長(zhǎng)度為19～24 nt內(nèi)源性非編碼的小分子RNA[12]，它在轉(zhuǎn)錄后水平起作用，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管形成和免疫應(yīng)答等多種生物過(guò)程[13]。由于外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能很好的保護(hù)其包被的物質(zhì)，因此外泌體內(nèi)miRNA相比于循環(huán)miRNA更加穩(wěn)定。因此，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA可以作為多種腫瘤疾病潛在標(biāo)志物及治療靶標(biāo)[14]。

筆者前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)HCC細(xì)胞系HepG2與過(guò)表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的HepG2細(xì)胞系的細(xì)胞上清外泌體進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miR-1290在過(guò)表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清的外泌體中含量顯著增高，由于HBx能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)多種miRNA的異常表達(dá)從而促進(jìn)HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展[15-17]，且外泌體的旁分泌途徑可能是一種新的致癌機(jī)制，故推測(cè)外泌體miR-1290可能與HBx參與肝癌有關(guān)。本研究通過(guò)收集HBV相關(guān)HCC患者標(biāo)本，探討HBV相關(guān)HCC患者血清外泌體miR-1290水平與疾病的關(guān)聯(lián)以及對(duì)其診斷效能的評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本及數(shù)據(jù)收集

90例血液樣本均全部來(lái)自于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，于2017年8月—2018年11月收集。其中健康體檢者（健康對(duì)照）19例，HBV攜帶者20例，乙型肝炎肝硬化患者20例，HBV相關(guān)HCC患者31例。HBV攜帶者樣本通過(guò)相關(guān)血清學(xué)檢驗(yàn)診斷；乙型肝炎肝硬化通過(guò)肝穿刺活檢或影像學(xué)檢查確診；HCC均通過(guò)組織病理學(xué)確診，且HCC患者血液樣本均在患者行外科手術(shù)或介入治療之前采集，4組樣本均排除合并其他腫瘤、丙肝病毒感染、自身免疫疾病及血液系統(tǒng)疾病。收集各組研究對(duì)象的基本信息及臨床相關(guān)資料。本項(xiàng)研究通過(guò)了中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有的研究對(duì)象均提供了知情同意和簽署了知情同意書(shū)。

1.2 血清外泌體的分離及鑒定

采用血清試管采集研究對(duì)象外周血3～5 mL，靜置15 min，室溫下3000 g離心15 min后吸取上層血清至EP管內(nèi)，放至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用血清外泌體分離試劑盒（ExoQuick exosome precipitation solution；貨號(hào)：EXOQ5A-1，美國(guó)SBI公司）分離提取血清外泌體，嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。將提取的外泌體樣品通過(guò)磷鎢酸負(fù)染色后置于透射電鏡下觀察外泌體顆粒的形態(tài)。利用Nano Sight納米顆粒跟蹤分析技術(shù)對(duì)所提取的外泌體顆粒粒徑進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Western blot來(lái)檢測(cè)血清外泌體表面特異性蛋白標(biāo)志物（CD63和TSG101蛋白分子），所使用的抗體包括CD63（中國(guó)ABclonal公司，A5271）、TSG101（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，HPA00616）、羊抗兔二抗（美國(guó)Proteintech公司，SA00001-2）。

1.3 外泌體miR-1290水平的檢測(cè)

應(yīng)用血清/血漿miRNA提取試劑盒（The miRNeasy Serum/Plasma Kit；目錄號(hào)：217184，德國(guó)Qiagen公司）嚴(yán)格依照使用說(shuō)明提取血清外泌體中的miRNA，測(cè)定miRNA的濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（All-in-One? miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit；貨號(hào)：QP013，美國(guó)GeneCopoeia ?公司）對(duì)提取的外泌體miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（反應(yīng)條件為：37 ℃ 1 h；85 ℃5 min），獲得cDNA。應(yīng)用RT-PCR試劑盒（Allin-One?miRNA qPCR Kit；貨號(hào)：QP010，美國(guó) GeneCopoeia?公司），采用SYBR法,以miR-16-5p為內(nèi)參進(jìn)行qPCR[18-19]（反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性12 s；60 ℃退火延伸1 min，上述進(jìn)行40個(gè)循環(huán)）。miR-1290正義鏈：5'-TGG ATT TTT GGA TCA GGG A-3'，反義鏈：5'-CGC GTG GAT TTT TGG ATC AGG GA-3'；miR-16-5p正義鏈：5'-TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC G-3'，反義鏈：5'-CGC TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC G-3'。通過(guò)應(yīng)用差異倍數(shù)=2-△△Ct法計(jì)算各組間miR-1290的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 7軟件制圖。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，偏態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位間距）[M（Q）]表示。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)或者M(jìn)ann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。利用ROC曲線評(píng)價(jià)血清外泌體miR-1290在HBV相關(guān)HCC中的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的一般資料

健康對(duì)照組年齡（43.95±13.53）歲，男13例，女6例；乙型肝炎肝硬化組和HBV攜帶組及HBV相關(guān)HCC組年齡分別為（49.35±10.74）歲、（44.95±10.73）歲、（50.58±12.8）歲，乙型肝炎肝硬化組和HBV攜帶組男、女性均為14例和6例，HBV相關(guān)HCC組為26例和5例。各組在性別、年齡、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白、總膽汁酸、AFP以及合并肝硬化方面均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），尤其是在白蛋白、AFP及合并肝硬化方面差異有明顯差異（均P＜0.001）。根據(jù)2017年版原發(fā)性肝癌診療規(guī)范[20]對(duì)HCC組進(jìn)行TNM分期及病理分級(jí)，其中早期（I+II期）與晚期（III+IV期）分別為13例和18例，分化程度良好（I+II級(jí)）與分化程度差（III+IV級(jí)）分別為26例和5例（表1）。

表1 各組研究對(duì)象的一般資料Table1 General information of each group of subjects

2.2 血清外泌體的鑒定

首先利用透射電鏡觀察所提取血清外泌體顆粒的形態(tài)，視野下可見(jiàn)多個(gè)直徑約50～100 nm呈茶托型或一側(cè)凹陷半球形的具有脂質(zhì)雙層膜囊狀顆粒（圖1A）。然后采用Western blot檢測(cè)外泌體表面特征性蛋白，結(jié)果顯示所提取的外泌體顆粒均表達(dá)CD63、TSG101標(biāo)志性蛋白分子，而無(wú)外泌體的血清則不表達(dá)或低表達(dá)CD63和TSG101（圖1B）。最后通過(guò)Nano Sight納米顆粒跟蹤分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)外泌體顆粒的粒徑，結(jié)果顯示樣品中顆粒分散均一，直徑呈單峰正態(tài)分布，主要分布在20～100 nm之間，峰值大約為66 nm（圖1C）。

圖1 血清外泌體鑒定 A：透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)；B：Western blot檢測(cè)外泌體CD63、TSG101特征性蛋白分子的表達(dá)（1、2為外泌體顆粒，3、4為無(wú)外泌體顆粒的血清）；C：Nanosight檢測(cè)外泌體顆粒粒徑Figure1 Identification of serum exosomes A:Morphology of exosomes was observed at 100 nm under transmission electron microscopy;B:Determination of the expression of characteristic molecules of exosome CD63 and TSG101 by Western blot (1, 2 showing the exosomal particles, and 3, 4 showinbg serum without exosomal particles); C:Detecting exosome particle size by Nanosight

2.3 血清外泌體miR-1290的表達(dá)

圖2 血清外泌體miR-1290在不同組間的表達(dá)情況Figure2 Expressions of serum exosomeal miR-1290 among different groups

各組之間兩兩比較血清外泌體miR-1290的表達(dá)水平，外泌體miR-1290在健康對(duì)照組與HBV攜帶組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；相較于其他3組，外泌體miR-1290在HBV相關(guān)HCC組的水平明顯升高（健康對(duì)照vs.HBV相關(guān)HCC，P＜0.001；乙型肝炎肝硬化vs.HBV相關(guān)HCC，P＜0.001；HBV攜帶vs.HBV相關(guān)HCC，P=0.002），但在乙型肝炎肝硬化組表達(dá)卻明顯下調(diào)（健康對(duì)照vs.乙型肝炎肝硬化：P=0.0036；HBV攜帶vs.乙型肝炎肝硬化：P=0.006）。此外，早、晚期HCC患者血清外泌體miR-1290相較于健康對(duì)照組表達(dá)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（健康對(duì)照vs.I+II HCC：P=0.0264；健康對(duì)照vs.III+IV HCC：P＜0.001），并且外泌體miR-1290在晚期HCC患者中的水平較早期HCC患者明顯升高（P=0.036）（圖2）。

2.4 血清外泌體miR-1290診斷效能的評(píng)估

圖3 外泌體miR-1290和AFP對(duì)HBV相關(guān)HCC的診斷效能Figure3 Diagnostic efficiencies of exosomeal miR-1290 and AFP for HBV-related HCC

采用ROC曲線評(píng)估外泌體miR-1290及AFP在HBV相關(guān)HCC中的診斷效能，結(jié)果顯示AFP的曲線下面積AUC值為0.792（95%CI=0.676～0.907，P＜0.001）（圖3）。外泌體miR-1290的曲線下面積AUC值為0.820（95%CI=0.730～0.910，P＜0.001）（圖3），靈敏度為61.3%，特異度為88.1%，截?cái)嘀禐?.511，具有良好的診斷效能。

3 討 論

HCC是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，其病情進(jìn)展迅速，治療困難，預(yù)后差，成為了全世界公認(rèn)的難題[21]。HBV感染是導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的最主要因素，高達(dá)50%的新診斷的HCC歸因于HBV的慢性感染，其中HBx可以干擾參與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的幾種信號(hào)通路從而促進(jìn)HCC的發(fā)生[22]。而且由于我國(guó)是乙肝大國(guó)，是世界上乙肝疾病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家[23]，因此針對(duì)乙肝人群的癌癥篩查診斷十分重要，就目前來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)更為準(zhǔn)確和非侵入性的生物標(biāo)志物去篩查及診斷肝癌仍然是具有緊迫性及挑戰(zhàn)性。

相較于血清而言，外泌體的應(yīng)用對(duì)于發(fā)現(xiàn)診斷生物標(biāo)志物具有一定的優(yōu)勢(shì)。事實(shí)上，外泌體可以選擇性地包裝和攜帶miRNA來(lái)代表其原始細(xì)胞或特定疾病，與健康個(gè)體相比，其在癌癥患者中的產(chǎn)量增加[24]。而且，研究[25]已經(jīng)證明外泌體可以保護(hù)其含有的miRNA免受富含循環(huán)的RNase的影響，這意味著外泌體miRNA更穩(wěn)定。最近的研究[26-30]就證明了循環(huán)外泌體miRNA可以作為各種疾病包括癌癥生物標(biāo)志物的潛能。本研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)HCC患者血清外泌體miR-1290表達(dá)顯著高于健康體檢者、HBV攜帶者及乙肝肝硬化患者，在HCC的不同階段表達(dá)也有所不同，HCC晚期較HCC早期表達(dá)明顯增高，并且經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-1290有比AFP更好的檢測(cè)效能，這一發(fā)現(xiàn)提示外泌體miR-1290水平可能具有衡量疾病發(fā)生發(fā)展的潛力，并提示HCC疾病的預(yù)后情況。miR-1290是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的小分子RNA，盡管已經(jīng)有很多研究先后發(fā)現(xiàn)miR-1290在各種癌癥中作用及影響，例如，Kobayashi等[31]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-1290在高級(jí)別漿液性卵巢癌患者血清中的水平顯著升高，可以作為高級(jí)別漿液性卵巢癌的一種新的潛在診斷生物標(biāo)志物；Mo等[32]發(fā)現(xiàn)miR-1290在非小細(xì)胞性肺癌中高表達(dá)，可用作非小細(xì)胞性肺癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物；Huang等[33]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-1290可以作為前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志物；同時(shí)還有大量的研究[34-35]證明miR-1290在胰腺癌、結(jié)直腸癌中發(fā)生發(fā)展的作用，但是miR-1290在HCC中卻甚少有研究，這也是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)。

雖然外泌體miR-1290水平在HBV相關(guān)HCC中明顯增高，然而在肝硬化組表達(dá)降低，其具體原因不明確，筆者推測(cè)這一趨勢(shì)與肝硬化患者生理基礎(chǔ)和代謝循環(huán)改變有關(guān)。肝硬化患者肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞活化以及血管床的紊亂增生，其中肝星狀細(xì)胞（HSC）活化是肝纖維化起始及進(jìn)展中的關(guān)鍵因素，然而肝硬化階段肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的生物活性是受到抑制的[36-38]，從而導(dǎo)致外泌體分泌量的降低和miR-1290水平的變化。而當(dāng)肝硬化進(jìn)展到肝癌階段，出現(xiàn)了克隆增生活躍的肝癌細(xì)胞，相應(yīng)的病理生理發(fā)生改變，在HBx的作用下細(xì)胞的外泌體分泌量和外泌體miR-1290含量均呈顯著增高趨勢(shì)，從而決定其對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的敏感性，然而具體原因及其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

另一方面，本研究也存在一定的局限性。首先是每組所收集的標(biāo)本量有限，這可能在一定程度上對(duì)實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生一定影響；其次，研究對(duì)象并沒(méi)有拓展到對(duì)非HBV相關(guān)的HCC，外泌體miR-1290在這類(lèi)HCC患者中表達(dá)情況是否也是上調(diào)仍然不得而知，同時(shí)也是將來(lái)進(jìn)一步探討研究的方向。

總之，血清外泌體miR-1290水平在HBV相關(guān)HCC患者中升高，且在晚期HCC高于早期HCC，因此，血清外泌體miR-1290在未來(lái)可能能成為診斷HBV相關(guān)HCC潛在的血清學(xué)標(biāo)志物。