童傳旺

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽蕪湖241000）

在正常衰老過程中，視覺能力會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性衰退，表現(xiàn)為視覺對(duì)比敏銳度下降、視銳度減弱、對(duì)物體朝向和運(yùn)動(dòng)方向辨別能力的障礙以及對(duì)視覺信息分析速度減慢等[1-2]，有關(guān)老年性視覺功能衰退的神經(jīng)機(jī)制尚處于探索階段[3]。一方面，老年性視覺功能衰退主要與視覺通路中哪些層次的神經(jīng)可塑性變化有關(guān)仍處于爭(zhēng)論之中[1，2，4-5]。盡管一些電生理研究結(jié)果顯示，外膝體（lateral geniculate nucleus，LGN）神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的反應(yīng)特性沒有明顯的年齡相關(guān)性變化，衰老可能主要影響視覺皮層特別是高級(jí)視覺皮層神經(jīng)元的功能[1，4-6]，但這并不能排除衰老過程中LGN可能發(fā)生的形態(tài)學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的改變[7]，這些改變可通過突觸聯(lián)系影響視皮層對(duì)視覺刺激的反應(yīng)特性。另一方面，老化引起視覺中樞神經(jīng)元功能衰退的細(xì)胞分子機(jī)制尚不清楚。最近的研究結(jié)果顯示，衰老伴隨著視覺中樞內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)（如GABA）表達(dá)減少[8]，神經(jīng)抑制作用減弱，這可能是導(dǎo)致視覺皮層神經(jīng)元對(duì)視覺刺激反應(yīng)的敏感性和選擇性下降的重要原因[9]，然而，引起抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)活動(dòng)降低的信號(hào)傳遞和分子機(jī)制卻知之甚少。

近些年對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）通過其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在神經(jīng)元的發(fā)育、存活、損傷修復(fù)和神經(jīng)可塑性等方面發(fā)揮著重要作用[10-12]。有報(bào)道顯示，BDNF信號(hào)系統(tǒng)可參與皮層內(nèi)活動(dòng)依賴的抑制行調(diào)節(jié)，并促進(jìn)GABA的合成和運(yùn)輸[13-15]。是否因衰老過程中BDNF及其受體表達(dá)下降，從而引起抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA分泌減少？目前尚無充足的試驗(yàn)證據(jù)，盡管有少數(shù)研究報(bào)道顯示，腦內(nèi)BDNF及其受體的表達(dá)出現(xiàn)了年齡相關(guān)性變化[16]。

貓作為研究視覺系統(tǒng)功能的模型動(dòng)物，因其視覺系統(tǒng)進(jìn)化較為高級(jí)且視覺組織結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)功能與人類較為相似。本研究選取外膝體作為視覺功能研究層次，基于外膝體在第一視覺通路中具有視覺信息初級(jí)整合編碼的“中繼站”作用，希望通過對(duì)外膝體開展相關(guān)研究，揭示外膝體水平上的有關(guān)視覺通路相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究資料。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，貓外膝體（LGN）內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達(dá)增齡性顯著降低[17]，這是否與BDNF及其受體的表達(dá)下調(diào)有關(guān)尚不清楚。為進(jìn)一步探討該問題，本研究以青、老年貓為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)方法研究外膝體中BDNF及其高親和力的酪氨酸激酶B受體（tyrosine kinase receptor，TrkB）表達(dá)以及低親和力受體蛋白（P75NTR）的年齡差異，為視覺功能衰老的細(xì)胞、分子機(jī)理的研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 試劑材料及試驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取2.0～3.5 kg體重貓為試驗(yàn)對(duì)象，試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)對(duì)象行眼部疾病檢查確保其視覺功能正常而消除干擾。選定青年組貓（1-3齡）與老年組（10-13齡）各4只進(jìn)行試驗(yàn)編組。施行鹽酸氯胺酮注射麻醉達(dá)足夠深度后（鹽酸氯胺酮按體重40 mg/kg計(jì)），立即采取開胸操作，并向心臟內(nèi)灌注生理鹽水（0.9%），待肝臟發(fā)白后灌注預(yù)固定液（戊二醛2.5%+福爾馬林10%+磷酸緩沖液pH7.2～7.4，0.1 mol/L，按體重200 mL/kg計(jì)）。開顱操作切取腦干部分繼續(xù)固定2 h。切取外膝體靜置于固定液（戊二醛2.5%+福爾馬林10%+蔗糖30%），直至腦組織塊完全固定沉入底部。制作厚20μm冰凍冠狀連續(xù)切片，隔5取4法選取切片編組（單只貓抽取10組），每組4片切片對(duì)應(yīng)BDNF、TrkB、P75NTR免疫染色組及空白對(duì)照組。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

室溫下滴注3% H2O2孵育、滅活內(nèi)源性過氧化物酶冰凍切片15 min；純水淋洗后，室溫下滴注PBS溶液（含TritonX-100：0.3%）孵育20 min；室溫下滴注小牛血清蛋白（5%）至完全封覆特異反應(yīng)部位孵育20 min；傾盡血清，滴注經(jīng)1∶100稀釋的一抗（分別為兔抗鼠BDNF及兔抗人TrkB、P75NTR多克隆抗體稀釋液）4℃恒溫孵育36 h；以PBS淋洗（5 min為1次，連續(xù)3次）；滴注二抗（羊抗兔IgG工作液）進(jìn)行反應(yīng)標(biāo)記，室溫下孵育20 min；以PBS淋洗（5 min為1次，連續(xù)3次）；滴注三抗SABC（鏈霉素過氧化物酶），室溫下孵育20 min；以PBS淋洗（5 min為1次，連續(xù)3次）；DAB染色顯色，切片經(jīng)常規(guī)梯度濃度酒精脫水操作后，二甲苯透明，中性樹膠封片并作鏡下檢查?？瞻讓?duì)照切片組，一抗代之以PBS液，余同處理。試驗(yàn)試劑盒、DAB購(gòu)自博士德生物公司。

1.3 觀察記錄形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)及分析處理

隨機(jī)抽取青年、老年組中BDNF、TrkB、P75NTR各20片染色切片進(jìn)行顯微觀察，并采集形態(tài)信息。觀察用顯微鏡型號(hào)為Olympus BX-51，圖像采集、分析信息軟件采用Image Pro Express 6.0軟件完成。主要觀察及采集信息指標(biāo)包括：BDNF、TrkB、P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞在貓外膝體各層的表達(dá)情況，以及免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度（以光吸收度均值IOD為參照，反應(yīng)強(qiáng)度越高，IOD值越大）。

低倍鏡下（40×）分別獲取BDNF、TrkB、P75NTR染色切片圖像，較高倍鏡下（100×）確定外膝體A、A1、C層結(jié)構(gòu)，再至高倍鏡（400×）下觀察計(jì)數(shù)。以“50μm×50μm”標(biāo)尺確定視野大小規(guī)格，各層視野數(shù)隨機(jī)選定10個(gè)。各視野內(nèi)統(tǒng)計(jì)BDNF、TrkB、P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，染色細(xì)胞胞體含有明顯的免疫陽(yáng)性物質(zhì)且具有細(xì)胞核為識(shí)別計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)各視野內(nèi)統(tǒng)計(jì)BDNF、TrkB、P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，多次觀察值取均值后結(jié)合視野大小轉(zhuǎn)換為細(xì)胞密度（cells/mm2）記錄。免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度IOD值測(cè)量以圖像采集軟件對(duì)切片隨機(jī)選取視野（每張切片20個(gè)）測(cè)量記錄。采集數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）形式記錄。分析統(tǒng)計(jì)由SPSS 13.0軟件進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)方法為ANOVA顯著性檢驗(yàn)及相關(guān)性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BDNF及TrkB、P75NTR陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)學(xué)信息統(tǒng)計(jì)分析

切片觀察發(fā)現(xiàn)，貓外膝體中各層中BDNF及TrkB、P75NTR陽(yáng)性細(xì)胞及纖維均有分布，胞體多呈棕黃或黃褐色。低倍鏡下可見外膝體A、A1層免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布較C層密集。高倍鏡下可見著色較深的呈卵圓形或不規(guī)則形陽(yáng)性細(xì)胞胞體，且陽(yáng)性細(xì)胞的突起結(jié)構(gòu)（神經(jīng)元軸、樹突及膠質(zhì)細(xì)胞突起）中亦可見免疫陽(yáng)性物質(zhì)分布（見圖1）。

圖1 貓外膝體A層中免疫陽(yáng)性細(xì)胞（箭頭指及）及纖維Figure 1 Show immunoreactive cells(arrows)and fibers in the LGN(lamina A)of cats

青年、老年組內(nèi)外膝體不同層次間數(shù)據(jù)比較檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在青年、老年組貓外膝體中，BDNF陽(yáng)性細(xì)胞的密度表現(xiàn)為A層和A1層分別較C層高[F（1，158）=27.12，P＜0.01；F（1，158）=40.06，P＜0.01]，A層 與A1層相比無顯著差異[F（1，158）=1.33，P=0.25]。青年、老年組間數(shù)據(jù)比較結(jié)果顯示，老年貓外膝體中BDNF免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度較青年貓顯著降低[F（1，158）=125.39，P＜0.01]，且各年齡組內(nèi)個(gè)體間無顯著差異[F（3，236）=1.11，P=0.35]。青年、老年組內(nèi)外膝體A層和A1層中的TrkB及P75NTR陽(yáng)性細(xì)胞密度亦較C層的高[TrkB組：F（1，158）=28.16，P＜0.01；F（1，158）=29.92，P＜0.01。P75NTR組：F（1，158）=44.14，P＜0.01；F（1，158）=33.13，P＜0.01]，A層與A1層相比無顯著差異[TrkB組：F（1，158）=0.02，P=0.89。P75NTR組：F（1，158）=1.23，P=0.14]。青年、老年組間數(shù)據(jù)比較結(jié)果顯示，老年組TrkB及P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度均較青年貓的顯著減小[TrkB組：F（1，158）=208.54，P＜0.01。P75NTR組：F（1，158）=320.58，P＜0.01]，且各年齡組內(nèi)個(gè)體間無顯著差異[TrkB組：F（3，236）=0.22，P=0.88。P75NTR組：F（3，236）=0.94，P=0.25]（見表1）。

數(shù)據(jù)相關(guān)性檢測(cè)分析結(jié)果提示：貓外膝體BDNF及TrkB、P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度變化之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（BDNF與TrkB相關(guān)系數(shù)r=0.87，P＜0.01；BDNF與P75NTR相關(guān)系數(shù)r=0.57，P＜0.01；TrkB與P75NTR相關(guān)系數(shù)r=0.61，P＜0.01）。

2.2 BDNF及TrkB、P75NTR受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：與青年組相比，老年組貓外膝體中BDNF陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度值顯著減小[F（1，78）=18.74，P＜0.01]，其中A、A1和C層分別下降幅度為26.4%、20.3%和36.3%。老年組TrkB陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度比青年組顯著減小[F（1，78）=28.46，P＜0.01]，其中A、A1和C層分別下降幅度為25.6%、26.5%和35.3%。老年組P75NTR陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度比青年組亦顯著減小[F（1，78）=39.72，P＜0.01]，其中A、A1和C層分別下降幅度為21.3%、18.5%和32.1%（見圖2）。

表1 青年組及老年組貓外膝體中BDNF及TrkB、P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度比較（mean SD）Table 1 A comparison on density of BDNF-IR and TrkB-IR，P75NTR-IR cells in the LGN of young and old cats(mean SD) cells/mm2

3 討論與結(jié)論

高等動(dòng)物主要依靠視覺功能獲得外部信息，衰老引起的視覺功能減退會(huì)直接影響生活的質(zhì)量。探討老年性視覺能力下降的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞分子機(jī)制，有利于通過醫(yī)學(xué)途徑延緩衰老對(duì)視覺的影響，提高老年人的視覺能力[18]。

在人和高等動(dòng)物中，視覺信息的加工分視網(wǎng)膜、外膝體和視皮層3個(gè)由低到高的層次。近些年的電生理研究結(jié)果顯示，衰老可能主要改變了視皮層神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的反應(yīng)特性，包括對(duì)刺激的方位和運(yùn)動(dòng)方向選擇性、對(duì)比度敏感性以及空間和時(shí)間頻率的選擇性等[19-21]，而衰老對(duì)外膝體神經(jīng)元反應(yīng)特性的影響似乎并不明顯[22]。盡管如此，我們并不能排除外膝體在細(xì)胞和分子水平的老年性變化。之前的研究發(fā)現(xiàn)老年貓外膝體中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達(dá)比青年貓的顯著減少[17]。神經(jīng)遞質(zhì)GABA的表達(dá)減少可能因?yàn)橄滦型坊蚱渌蛩氐难a(bǔ)償作為而沒有在功能水平表現(xiàn)出來。因此，衰老對(duì)外膝體的影響主要表現(xiàn)在細(xì)胞水平。

圖2 貓外膝體中BDNF、TrkB及P75NTR免疫陽(yáng)性反應(yīng)的平均光吸收IOD值Figure 2 Show the mean IOD(Integrated optical density)value of BDNF and TrkB，P75NTR immunoreactivity in the LGN of cats

近些年對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的研究結(jié)果顯示，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF通過其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、存活及突觸可塑性等具有重要作用[23]。BDNF受體主要包括高親和力的受體Trk和低親和力的P75NTR受體，其中Trk類受體與BDNF特異性結(jié)合直接發(fā)揮特定功能，而低親和力受體P75NTR雖可與各類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子廣泛結(jié)合，其并非為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮功能的必需因子。一般認(rèn)為P75NTR主要為增強(qiáng)高親和力受體TrkB與BDNF高親和結(jié)合位點(diǎn)的形成過程，并增強(qiáng)TrkB受體表達(dá)的時(shí)階特異性與組織特異性[24]。有相關(guān)研究證實(shí),BDNF參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于GABA能神經(jīng)元的發(fā)育、存活和功能表達(dá)具有重要的支持作用[25-27]，并可能直接參與腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)[13-14]。是否老年動(dòng)物外膝體中GABA表達(dá)的下降與BDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用異常引起的，目前尚缺乏充足的試驗(yàn)證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，老年貓和青年組貓外膝體各層神經(jīng)元密度沒有顯著差異，表明在衰老過程中外膝體神經(jīng)元的數(shù)量維持相對(duì)穩(wěn)定，這與以前的研究報(bào)道結(jié)果一致[17]。然而，老年貓外膝體各層中BDNF和TrkB、P75NTR免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度比青年貓的顯著下降，且BDNF和TrkB、P75NTR的免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度亦明顯減弱。這一結(jié)果提示老年組貓中神經(jīng)元的絕對(duì)數(shù)量并未發(fā)生顯著減少，而BDNF和TrkB、P75NTR相關(guān)的特異神經(jīng)元陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)出的在數(shù)量和強(qiáng)度上的顯著減弱提示老年個(gè)體BDNF-TrkB調(diào)節(jié)功能呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。類似的結(jié)果也在視覺高級(jí)結(jié)構(gòu)初級(jí)視皮層BDNF年齡相關(guān)性表達(dá)變化研究中亦有報(bào)告[28]。阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）患者及老齡大鼠的海馬中也曾報(bào)道過較一致的觀察結(jié)果[16，29-30]，表明在衰老過程中BDNF與TrkB、P75NTR的表達(dá)減少，BDNF-TrkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)降低。

總之，本研究結(jié)果表明，衰老會(huì)引起外膝體各層中BDNF與TrkB、P75NTR受體的表達(dá)下調(diào)，P75NTR介導(dǎo)的BDNF-TrkB結(jié)合過程的活化減弱，BDNF-TrkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)減弱可能導(dǎo)致GABA表達(dá)下降，這些抑制性神經(jīng)末梢通過突觸前和突觸后抑制作用的減弱可能亦會(huì)影響視皮層神經(jīng)元對(duì)視覺刺激反應(yīng)的選擇性和敏感性，從而引起老年性視覺能力減退。