貴州地區(qū)非阻塞性無精癥與SIRPA-SIRPG基因rs6080550多態(tài)性的相關(guān)性*＊

王嬋娟，何 燕，張 婷，王治海，禹文峰，官志忠，安 宇

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽550004;3.貴州省人民醫(yī)院中心實驗室，貴州貴陽 550002)

我國孕齡期夫妻不孕不育的發(fā)生率大約為15%～20%，因男方因素導(dǎo)致的不孕不育約為50%，其中無精癥是造成男子不育的重要原因之一，約占不育男性的15%［1］。無精癥可分為阻塞性無精癥(obstructive azoospermic，OA)和非阻塞性無精癥(non-obstructive azoospermic，NOA)，其中非阻塞性無精癥是指男性睪丸生精細(xì)胞發(fā)生萎縮退化不能產(chǎn)生精子［2］。已有研究顯示男性非阻塞性無精癥中精子的生成障礙與Y染色體微缺失、X染色體與常染色體的基因突變以及減數(shù)分裂遺傳重組缺陷有關(guān)［3－4］，隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study，GWAS)成為一種有效的研究復(fù)雜疾病發(fā)病基因及其位點的手段，它主要通過對大樣本人群DNA樣本進(jìn)行全基因組高密度單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點分型，從而揭示與疾病發(fā)生相關(guān)的遺傳位點［5］。目前已有少數(shù)研究通過GWAS找到了一些可能與非阻塞性無精癥相關(guān)的基因區(qū)域，并在后續(xù)相關(guān)的SNP與非阻塞性無精癥的相關(guān)研究中探討這些SNP與無精癥的關(guān)聯(lián)［6］，信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPA)和信號調(diào)節(jié)蛋白γ(SIRPG)蛋白編碼區(qū)則是其中之一，已有的研究表明 SIRPA和SIRPG蛋白編碼區(qū)的突變和無精癥風(fēng)險性相關(guān)，rs6080550(C/T)則是其中一個多態(tài)位點;SIRP是信號調(diào)節(jié)蛋白家族，是受體膜上的糖蛋白，參與了負(fù)向調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶的級聯(lián)過程，但其基因在精子生成中的作用目前尚未見報道。本研究選取rs6080550作為研究靶點，以貴州地區(qū)非阻塞性無精癥患者和正常男性健康對照人群為研究對象，探討該位點的多態(tài)性與貴州非阻塞性無精癥的相關(guān)性，以期為貴州人群非阻塞性無精癥的診斷及預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對象

在知情同意的原則下隨機(jī)選取臨床確診的非阻塞性無精癥患者145例［(46.5±20.2)歲］及正常男性健康體檢人群174例［(48.3±12.9)歲］，分為疾病組及對照組。疾病組平均不育年限4.5年，臨床檢查已排除精索靜脈曲張、生殖道梗阻、隱睪、附睪損傷等其他泌尿生殖系統(tǒng)疾患，且無特殊病史及家族史，經(jīng)精液檢查，均確診為非阻塞性無精癥。

1.2 試劑與儀器

人基因組rs6080550(C/T)SNP位點TaqMan探針分型試劑盒(TaqMan SNP Genotyping Assays，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，TaqMan Genotyping Master Mix(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，NanoDropTMLite分光光度計(美國Thermo Fisher公司，ABI stepone Plus Real-time PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3 基因組DNA提取及定量

對研究人群全血采用酚/氯仿抽提法抽提基因組DNA，NanoDropTMLite分光光度計測量DNA的濃度及純度，將每個DNA樣本統(tǒng)一稀釋成濃度為20μg/L的應(yīng)用液。

1.4 SIRPA-SIRPG基因rs6080550(C/T)SNP位點基因分型

對研究人群采用人基因組rs6080550(C/T)SNP位點TaqMan探針分型試劑盒進(jìn)行基因分型，ABI Stepone Plus Real-time PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增總體積10μL，包含2×TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL、40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 0.25 μL、DNA 模板 1.5 μL、ddH2O 3.25 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃熱變性10 min，92℃變性15 s，60℃退火1 min，共30個循環(huán)。使用StepOne Software v2.1軟件，讀取熒光信號，通過X、Y軸散點圖分析及測序結(jié)果確定樣本的基因型。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，直接計數(shù)法統(tǒng)計位點的基因型頻率和等位基因頻率，組間基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，設(shè)定P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRPA-SIRPG基因rs6080550位點基因型及等位基因頻率

對照組人群基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=1.0)。疾病組及對照組基因型與等位基因頻率分布的卡方檢驗結(jié)果如表1所示。rs6080550(C/T)基因型及等位基因頻率分布，在疾病組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。疾病組TT基因型及T等位基因頻率均顯著高于對照組(P＜0.05)。

表1 SIRPA-SIRPG基因rs6080550基因型和等位基因頻率分布(n，%)Tab.1 Frequency distribution of rs6080550 genotypes and alleles in SIRPA-SIRPG gene

2.2 SIRPA-SIRPG基因rs6080550位點基因型頻率與非阻塞性無精癥的患病風(fēng)險

SIRPA-SIRPG基因rs6080550位點基因型頻率與非阻塞性無精癥的相關(guān)性分析見表2。基因型頻率結(jié)果顯示rs6080550(T/T)增加人群中的非阻塞性無精癥患病風(fēng)險，OR=13.52，P＜0.05。

表2 rs6080550基因型頻率與非阻塞性無精癥患病風(fēng)險的關(guān)系Tab.2 Relationship between rs6080550 genotype frequency and risk of non-obstructive azoospermia

3 討論

男性非阻塞性無精癥的主要原因是精子生成障礙，精子發(fā)生是精原細(xì)胞相繼分化成初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞及精子細(xì)胞，并最終形成成熟精子的過程，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致精子發(fā)生停滯，從而導(dǎo)致無精癥。目前已有的研究顯示男性非阻塞性無精癥中精子的生成障礙與Y染色體微缺失、Y染色體gr/gr缺失、X染色體與常染色體的基因突變以及減數(shù)分裂遺傳重組缺陷有關(guān)［3－4］。

SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。據(jù)研究揭示，與精子發(fā)生相關(guān)的基因大約有2 300多個［7］，而基因異常通常被認(rèn)為是非阻塞性無精癥的一個主要風(fēng)險因素［8］，一直以來關(guān)于精子發(fā)生相關(guān)的基因如FKBP6、蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT6)、過氧化體生物合成因子10(PEX10)、轉(zhuǎn)錄因子SOX5(SOX5)、芳香化酶19(CYP19)等基因的SNP多態(tài)性與非阻塞性無精癥相關(guān)的研究報道層出不窮［9－13］。大量研究致力于通過現(xiàn)代測序技術(shù)和大規(guī)模的基因芯片技術(shù)尋找導(dǎo)致非阻塞性無精癥新的易感基因，但是，超過50%的無精癥的致病因素仍未可知［14］。

近年來，GWAS為非阻塞性無精癥與易感基因SNP多態(tài)性的研究提供了更好的依據(jù)，南京醫(yī)科大學(xué)胡志斌教授團(tuán)隊在Nature Genetics上發(fā)表了一篇在中國人群中和非梗阻性無精癥相關(guān)的GWAS研究文章，研究中選取1 000例無精癥病人和1 703例對照對906 703 SNPs進(jìn)行了分析，鎖定了一些與非阻塞性無精癥可能關(guān)聯(lián)的基因區(qū)域和位點［6］，SIRPA-SIRPG基因 6080550(C/T)即是其中之一。本次研究選擇貴州地區(qū)人群，在貴州非阻塞性無精癥患者和正常男性健康體檢人群共319例樣本中對GWAS報道的SIRPA-SIRPG基因rs6080550(C/T)進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證分析，探討該位點的多態(tài)性與非阻塞性無精癥的相關(guān)性，為貴州人群非阻塞性無精癥的診斷及預(yù)防干預(yù)提供一定的理論依據(jù)。

本次結(jié)果顯示rs6080550基因型分布在非阻塞性無精癥疾病組和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，疾病組rs6080550(TT)基因型頻率顯著高于對照組，該位點T等位基因頻率在疾病組中的分布也明顯高于對照組。同時，對該位點3種基因型患病風(fēng)險OR值的評估中，rs6080550(TT)基因型OR值為13.52，遠(yuǎn)大于1(P＜0.05)，結(jié)果顯示攜帶TT基因型可能增加非阻塞性無精癥的患病風(fēng)險，可能是疾病的危險因素。對比目前國內(nèi)外對該位點的研究，日本曾對490例非阻塞性無精癥患者及對照進(jìn)行了基因分型分析，所得結(jié)果顯示rs6080550位點基因的多態(tài)性與無阻塞性無精癥并沒有顯著相關(guān)性，rs6080550位點多態(tài)性并非無精癥的危險因素(OR=0.96)［15］;國內(nèi)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院也對胡志斌教授團(tuán)隊報道的位點進(jìn)行了驗證實驗，也未得到SIRPA-SIRPG基因6080550(C/T)位點與非阻塞性無精癥相關(guān)的結(jié)果［16］。而本次對貴州人群的研究得到的結(jié)果與GWAS研究結(jié)果一致，rs6080550基因多態(tài)與非阻塞性無精癥相關(guān)。鑒于目前對該位點研究結(jié)果存在的爭議，可能需要更大的獨立集合的病例對照樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究，對結(jié)果的確定可能還需要更大的人群樣本作為分析基礎(chǔ)。