余亮亮 李朋

浙江省麗水市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江麗水 323000

研究顯示，育齡期夫婦的不孕不育癥發(fā)病率約為10%～15%，其中30%是由男性因素所引起，少精癥、弱精癥是導(dǎo)致男性不育的主要原因[1,2]。由于精液的異質(zhì)性，多數(shù)少精癥、弱精癥患者的發(fā)病機制尚不明確[3]。精子中約有90%的基因處于活躍的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，微小核糖核酸是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，大小約19～26 個核苷酸，參與人體多種生理過程，在精原干細胞自我更新、分裂繁殖及精子的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。微小核糖核酸-34c（miR-34c）是miRNAs 家族的重要成員，有研究顯示，miR-34c對正常睪丸功能、調(diào)節(jié)精子成熟和功能發(fā)揮重要作用[5]，故推測miR-34c 可能與少精癥、弱精癥患者的精液質(zhì)量有一定的關(guān)系。因此，本研究通過檢測精漿miR-34c 表達水平，探討其與少精癥、弱精癥患者精液質(zhì)量的關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2022 年3 月浙江省麗水市人民醫(yī)院收治的135 例少精癥患者為少精癥組，156例弱精癥患者為弱精癥組，同期選取150 例育齡期健康男性為對照組。納入標準：①少精癥組、弱精癥組患者均符合世界衛(wèi)生組織相關(guān)診斷標準[6]；②年齡22～40 歲；③少精癥組、弱精癥組受試者的夫妻性生活正常且未采取避孕措施2 年以上而未能生育者；④配偶婦科檢查結(jié)果正常；⑤對照組經(jīng)精液標本檢查結(jié)果正常；⑥受試者依從性好；⑦受試者均知情同意。排除標準：①泌尿生殖系統(tǒng)感染；②其他原因?qū)е碌哪行圆辉腥珉[睪、染色體異常、化療等；③采樣期間吸煙、酗酒等；④合并其他慢性疾?。虎菰煅到y(tǒng)疾??；⑥精神疾病患者；⑦射精障礙者。少精癥組受試者年齡 24～40 歲，平均（33.15±6.32）歲；體質(zhì)量指數(shù)21～29kg/m2，平均（25.48±2.67）kg/m2；弱精癥組受試者年齡22～39歲，平均（31.86±6.89）歲；體質(zhì)量指數(shù)20～29kg/m2，平均（26.04±2.54）kg/m2；對照組受試者年齡22～40 歲，平均（32.85±5.36）歲；體質(zhì)量指數(shù)22～29kg/m2，平均（25.77±2.47）kg/m2。三組受試者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)浙江省麗水市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準（批件號：201912-003）。

1.2 研究方法

1.2.1 精子樣本采集與制備 樣本采集前禁欲1 周，采用手淫法取精液于無菌取精杯中，于37℃恒溫箱中靜置30min，至完全液化后進行常規(guī)精液檢查，以1500 轉(zhuǎn)/min 離心10min，12000 轉(zhuǎn)/min 離心5min，取精漿2～3ml，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 常規(guī)精液質(zhì)量檢查 采用RT-S100 精子質(zhì)量分析儀（深圳市瑞圖生物技術(shù)有限公司）進行精液量、精子正常形態(tài)率、精子濃度、精子活力a+b 級百分比（a 級為精子運動狀況極好，呈快速直線前向運動；b 級為精子運動狀況很好，呈前向的曲線運動；a+b 級>50%為精子活力正常）及精子前向運動率檢查。

1.2.3 精漿miR-34c表達水平檢測 使用Trizol試劑盒（美國Invitrogen 公司）提取精漿總RNA，取200μl預(yù)處理的精漿樣本，加入1ml Trizol 混勻，倒入裝有氯仿、異丙醇和95%乙醇的離心管中，獲得總RNA；用cDNA 合成試劑盒（北京天根生化科技公司）進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，加入SYBR Premix ExTap，使用MA-6000 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司）進行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃，15s；60℃，60s，40 個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3 個復(fù)孔，以焦碳酸二乙酯處理過的雙蒸水為陰性對照，以U6 為內(nèi)參，各引物擴增序列見表1。

表1 引物擴增序列

1.3 觀察指標

比較三組的精漿miR-34c 表達水平、精液質(zhì)量（包括精液量、精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率），并分析少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，計量資料均行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗；采用Pearson 相關(guān)性分析少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達與精液質(zhì)量的關(guān)系，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的精漿miR-34c 表達水平比較

三組的精漿miR-34c 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），少精癥組、弱精癥組的miR-34c表達水平均低于對照組（P<0.05），少精癥組與弱精癥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 三組的精漿miR-34c 表達水平比較（ ）

表2 三組的精漿miR-34c 表達水平比較（ ）

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 三組的精液質(zhì)量參數(shù)比較

三組的精液量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；三組的精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；少精癥組、弱精癥組的上述指標均低于對照組（P<0.05），少精癥組的精子總數(shù)、精子濃度低于弱精癥組（P<0.05），少精癥組的精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率高于弱精癥組（P<0.05），見表3。

表3 三組的精液質(zhì)量參數(shù)比較（ ）

表3 三組的精液質(zhì)量參數(shù)比較（ ）

注：與對照組比較，*P<0.05；與弱精癥組比較，#P<0.05

2.3 少精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，少精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液量無相關(guān)性（P>0.05），與精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比及精子前向運動率呈正相關(guān)（P<0.05），見表4。

表4 少精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

2.4 弱精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，弱精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液量無相關(guān)性（P>0.05），與精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比及精子前向運動率呈正相關(guān)（P<0.05），見表5。

表5 弱精癥組的精漿miR-34c 表達水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

3 討論

少精癥、弱精癥是導(dǎo)致男性不育的常見原因，好發(fā)于精索靜脈曲張、內(nèi)分泌異常、生殖道感染者[7,8]，其精液質(zhì)量如精子總數(shù)、精子濃度、精子活力等降低，不僅影響不育者的身體健康，還帶來嚴重的心理壓力。本研究中少精癥組、弱精癥組的精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率均低于對照組，提示少精癥、弱精癥患者的精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率均低于正常水平，與于忠英等[9]的研究一致。另外，少精癥組的精子總數(shù)、精子濃度低于弱精癥組，但少精癥組的精子活力a+b 級百分比、精子前向運動率高于弱精癥組，提示少精癥患者的精子總數(shù)、精子濃度更低，弱精癥患者的精子活力a+b級百分比、精子前向運動率更低。少精癥又稱作精子減少癥，主要表現(xiàn)為精子減少，但同時精子活力較正常水平減弱；弱精癥主要表現(xiàn)為精子活動力低下，但同時精子數(shù)量較正常水平減少[10-12]。

本研究結(jié)果顯示，少精癥組、弱精癥組的miR-34c表達水平均低于對照組，少精癥組與弱精癥組間無明顯差異，提示少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c表達水平低于健康育齡期男性，推測miR-34c 可能參與少精癥、弱精癥的病理過程。miR-34c 是miR-34家族成員，miR-34 家族在進化中是一類保守的miRNA 家族，成熟的miR-34c 序列位于同一主基因原初轉(zhuǎn)錄本的外顯子內(nèi)[13,14]。Dorostghoal等[15]研究顯示，不育者的精子miR-34c-5p 含量顯著低于可育對照者，本研究結(jié)果與之一致，證實miR-34c 與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)[16]。

本研究進一步相關(guān)性分析miR-34c 表達水平與精漿質(zhì)量的關(guān)系，結(jié)果顯示，少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達水平與精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級百分比及精子前向運動率呈正相關(guān)，提示miR-34c 表達水平與少精癥、弱精癥患者的精液質(zhì)量存在緊密聯(lián)系。王凡等[17]研究顯示，MicroRNA-34b/c 位點rs4938723 與男性不育相關(guān)。Momeni等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b/c 啟動子區(qū)域的高甲基化可引起miR-34 家族異常低表達，進而影響精液質(zhì)量。另有相關(guān)研究報道，miR-34c 具有相似或相同的種子序列，能夠與3’-UTR 區(qū)域結(jié)合，從而對基因表達產(chǎn)生影響，同時調(diào)節(jié)患者的免疫系統(tǒng)，在精子的生成中發(fā)揮作用[19]。Welponer等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a 和miR-34b/c 的啟動子區(qū)域存在p53 結(jié)合位點，p53 能夠直接調(diào)節(jié)miR-34 家族成員的表達進而影響生精細胞的凋亡、精母細胞的分裂等過程?；谝陨涎芯坎聹ymiR-34c 的表達水平能夠影響精子質(zhì)量，臨床可嘗試通過調(diào)控miR-34c 的表達治療少精癥、弱精癥。

綜上，少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達水平低于正常水平，且與精液質(zhì)量呈正相關(guān)，miR-34c的異常表達可能是影響少精癥、弱精癥患者精液質(zhì)量的原因之一。