• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看

      ?

      L-肌肽對魚藤素誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護作用

      2019-03-13 08:42:08柳傳毅陳彥潔方瓊彤呂滿霞吳新榮
      中國藥理學(xué)通報 2019年3期
      關(guān)鍵詞:肌肽培養(yǎng)箱批號

      柳傳毅,陳彥潔,方瓊彤,呂滿霞,吳新榮

      (1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科,廣州市老年慢病患者合理用藥重點實驗室,廣東 廣州 510010)

      肌肽是主要由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內(nèi)源性二肽,目前的研究證實,肌肽具有清除自由基、抗氧化活性,藥理活性廣泛。因肌肽具有高效的藥理活性和低毒的特征,研究者認(rèn)為,其可以為阿爾茨海默癥、腦卒中等疾病的治療提供新的方向。Holliday等[6]在MRC-5成纖維細(xì)胞和HeLa細(xì)胞模型上,研究得出20~50 mmol·L-1的肌肽并不影響正常二倍體人成纖維細(xì)胞的生長,但是能促進細(xì)胞的生長。目前尚未完全得出PD發(fā)病機制,但已被證實的機制有氧化應(yīng)激、清除自由基等。Boldyrev等[7]報道,肌肽能夠明顯改善PD神經(jīng)癥狀,并能提高血紅細(xì)胞中Cu/Zn-超氧化物歧化酶的活性。研究報道,肌肽對臨床上的多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的毒副作用具有保護作用。Noori等[8]實驗證實,肌肽能夠有效抑制由順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的超氧化物歧化酶、過氧化物水平的降低。綜上所述,肌肽主要是通過清除自由基、抗氧化應(yīng)激等機制發(fā)揮作用,由此可得出肌肽是一種極具有潛在治療PD的藥物。本研究以SH-SY5Y細(xì)胞作為模型,研究L-肌肽是否通過抗氧化應(yīng)激作用,來降低由魚藤素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,進而探究魚藤素的神經(jīng)毒性。

      1 材料

      1.1細(xì)胞株人神經(jīng)瘤細(xì)胞株 SH-SY5Y,由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科提供。

      1.2試劑魚藤素(deguelin,批號:045M4736V,HPLC級)、L-肌肽(批號:BCBQ8925V)、二甲基亞砜(批號:RNBD6895)、Accutase solution(細(xì)胞消化液,批號:SLBN5790V),均購自Sigma公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號:C1065-2)、活性氧檢測試劑盒(批號:S0033-1),均購自碧云天公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司,批號:20151225;CCK-8試劑,日本同仁公司,批號:JU739;RPMI 1640培養(yǎng)基,Gibco公司,批號:8116053;吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染試劑盒,索萊寶公司,批號:20160111。

      1.3儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiscan-GO全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);YSK-319型倒置顯微鏡、IX7型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);YSK-239型低溫高速離心機(Sigma公司);流式細(xì)胞儀(美國Millipore公司)。

      2 方法

      2.1藥物的配制

      2.1.1魚藤素的配制 1 mmol·L-1魚藤素母液配制:在6.3 mL的DMSO溶液中溶解2.5 g魚藤素,并在-20 ℃條件下避光保存,不同溶度的魚藤素用培養(yǎng)基稀釋,現(xiàn)配現(xiàn)用。

      2.1.2L-肌肽的配制 將L-肌肽加入到不同體積的培養(yǎng)基中,配制成實驗所需濃度,并用無菌過濾膜過濾,現(xiàn)配現(xiàn)用。

      5.實驗環(huán)境。在檢驗過程中環(huán)境溫度控制不到位,使得溫度增加變化較大,會影響到檢驗儀器設(shè)備、試劑的正常運行和工作,使得儀器的精準(zhǔn)度發(fā)生變化,繼而影響到食品檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

      2.2細(xì)胞培養(yǎng)從細(xì)胞庫中取出SH-SY5Y細(xì)胞,快速解凍并在超凈臺上將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中,加入適量已配好的新鮮培養(yǎng)基,離心,取下沉液,后加入新鮮的培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

      2.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期細(xì)胞,將細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞密度為5×107·L-1,每孔接種細(xì)胞100 μL后,放入5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),使細(xì)胞貼壁。

      2.3.1L-肌肽對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 次日加藥前,去除舊的培養(yǎng)基,每組設(shè)5個復(fù)孔,其中實驗組每孔100 μL,加入不同濃度的L-肌肽(1、10、20、40、60、80、100 mmol·L-1),其中空白組無細(xì)胞,只有培養(yǎng)基,對照組只加相同培養(yǎng)基。加藥后,96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

      2.3.2L-肌肽對魚藤素抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖作用的影響 次日加藥前,去除舊的培養(yǎng)基,后加入100 μL不同濃度的藥物,其中實驗組加入情況如下:A組:8 μmol·L-1魚藤素;B組:8 μmol·L-1魚藤素+3 mmol·L-1L-肌肽;C組:8 μmol·L-1魚藤素+30 mmol·L-1L-肌肽;D組:20 μmol·L-1魚藤素;E組:20 μmol·L-1魚藤素+3 mmol·L-1L-肌肽;F組:20 μmol·L-1魚藤素+30 mmol·L-1L-肌肽;G組:50 μmol·L-1魚藤素;H組:50 μmol·L-1魚藤素+3 mmol·L-1L-肌肽;I組:50 μmol·L-1魚藤素+30 mmol·L-1L-肌肽,每組設(shè)置5個復(fù)孔,對照組只加培養(yǎng)基,空白組無細(xì)胞,只加培養(yǎng)基。加藥后,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,除去舊培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基與CCK-8試劑按照9 ∶1的比例配制成混合溶液后,每孔加入100 μL混合液,培養(yǎng)板繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),避光反應(yīng)2 h,在450 nm波長處,酶標(biāo)儀測定吸光度。細(xì)胞存活率/%=[(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100%。實驗平行重復(fù)3次。

      2.4AO/EB法檢測細(xì)胞形態(tài)和凋亡情況取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種在6孔板中,每孔接種3 mL密度為5×107·L-1,均勻分布。在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),使細(xì)胞貼壁。不同實驗分組如下:A組:對照組,只加培養(yǎng)基;B組:20 μmol·L-1魚藤素;C組:30 mmol·L-1L-肌肽;D組:20 μmol·L-1魚藤素+30 mmol·L-1L-肌肽。作用24 h后,用PBS溶液洗滌2次,每孔加入1 mL的PBS。配制AO溶液 ∶EB溶液=1 ∶1的工作液,每孔加入20 μL工作液,室溫放置5 min。最后在熒光倒置顯微鏡下進行觀察,并拍照。

      2.5AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種6孔板,每孔接種3 mL密度為5×107·L-1,均勻分布,在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),使細(xì)胞貼壁。次日除去舊培養(yǎng)基并加藥,實驗分組情況同“2.3.2”。藥物作用24 h后,收集細(xì)胞液,并用PBS液洗滌2次,在顯微鏡下計數(shù),將細(xì)胞液重懸于EP管中,除去上清液,加入195 μL結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC混勻,混勻后加入10 μL PI,混勻液再次混勻,后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

      2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS水平取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種6孔板,每孔接種3 mL密度為5×107·L-1,均勻分布。在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),使細(xì)胞貼壁。不同實驗分組同“2.3.2”。24 h后收集細(xì)胞液,離心5 min,吸取上清液,用無血清培養(yǎng)基按1 000 ∶1比例稀釋10 mmol·L-1DCFH-DA母液,用1 mL稀釋液懸浮細(xì)胞,在37 ℃避光條件下孵育30 min,期間每隔5 min振蕩1次,離心后,PBS洗滌,PBS重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS水平。

      3 結(jié)果

      3.1L-肌肽對細(xì)胞存活率的影響如Fig 1所示,與對照組相比,藥物作用24 h后, 0~100 mmol·L-1的L-肌肽對SH-SY5Y細(xì)胞的存活率并沒有明顯影響,在最高濃度100 mmol·L-1時,其對細(xì)胞存活率的影響無統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)果說明,在0~100 mmol·L-1范圍內(nèi),L-肌肽對SH-SY5Y細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。Holliday等[9]研究證實,20~50 mmol·L-1肌肽不僅不影響正常二倍體成纖維細(xì)胞的存活,而且還能促進細(xì)胞的生長,故本實驗選取低濃度3 mmol·L-1的L-肌肽與30 mmol·L-1的L-肌肽。

      Fig 1 Effect of different concentrations of L-carnosine treated 24 h on viability of SH-SY5Y cells n=3)

      如Fig 2 所示,藥物作用24后,3 mmol·L-1與30 mmol·L-1的L-肌肽和魚藤素共作用于SH-SY5Y細(xì)胞,能有效降低魚藤素對細(xì)胞的抑制作用。與魚藤素單獨作用的細(xì)胞的抑制率相比,3 mmol·L-1L-肌肽與20 μmol·L-1魚藤素對細(xì)胞的抑制率降低了5.01%(P<0.05),30 mmol·L-1L-肌肽與20、50 μmol·L-1魚藤素對細(xì)胞的抑制率分別降低9.07%和6.1%(P<0.05)。結(jié)果表明,30 mmol·L-1L-肌肽能夠有效降低魚藤素對SH-SY5Y細(xì)胞的增殖抑制作用,保護SH-SY5Y細(xì)胞。

      Fig 2 Effect of different concentrations of deguelin and L-carnosine treated 24 h on inhibitory rate of SH-SY5Y cells n=3)

      **P<0.05,**P<0.01vs0 mmol·L-1L-carnosine group

      3.2L-肌肽對細(xì)胞形態(tài)和凋亡的影響24 h后,細(xì)胞凋亡形態(tài)如Fig 3所示,30 mmol·L-1L-肌肽處理組,核內(nèi)染色質(zhì)均勻,細(xì)胞呈多邊形,少見明顯的凋亡特征。C組20 μmol·L-1魚藤素處理組,部分細(xì)胞表現(xiàn)出早期凋亡特征,細(xì)胞體積減小,核固縮呈新月狀。D組30 mmol·L-1L-肌肽和20 μmol·L-1魚藤素組,早期凋亡細(xì)胞數(shù)減少,表明L-肌肽能有效的降低魚藤素對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

      3.3L-肌肽影響細(xì)胞凋亡率Tab 1、Fig 4結(jié)果顯示,與單獨魚藤素的C組相比,D組的早期凋亡率降低9.35%,總凋亡率降低10.7%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明L-肌肽可有效保護細(xì)胞,抑制細(xì)胞凋亡。

      Fig 3 Apoptotic morphology of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 h with AO/EB double stained (×200)

      A: Control group; B: 30 mmol·L-1L-carnosine treated group; C: 20 μmol·L-1deguelin treated group; D: 20 μmol·L-1deguelin and 30 mmol·L-1L-carnosine cotreated group. Arrows: apoptotic cell.

      Tab 1 Apoptotic rate of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 n=3)

      A: Control group; B: 30 mmol·L-1L-carnosine treated group; C: 20 μmol·L-1deguelin treated group; D: 20 μmol·L-1deguelin and 30 mmol·L-1L-carnosine co-treated group.*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

      Fig 4 Apoptotic rate of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 h

      A: Control group; B: 30 mmol·L-1L-carnosine treated group; C: 20 μmol·L-1deguelin treated group; D: 20 μmol·L-1deguelin and 30 mmol·L-1L-carnosine co-treated group.

      3.4L-肌肽影響細(xì)胞的ROS水平如Fig 5所示,與對照組相比,30 mmol·L-1L-肌肽作用后,SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組30 mmol·L-1L-肌肽和魚藤素共處理組,ROS水平較魚藤素單獨處理組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明L-肌肽的神經(jīng)保護作用可能是通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平實現(xiàn)的。

      4 討論

      SH-SY5Y細(xì)胞是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞,衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系,其具有酪氨酸羥化酶、多巴胺羥化酶活性和多巴胺轉(zhuǎn)運體, 因此,該細(xì)胞系被廣泛運用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的研究,特別是應(yīng)用于PD發(fā)病機制的研究。本研究以SH-SY5Y細(xì)胞為模型,用CCK-8法檢測L-肌肽對細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明,高濃度100 mmol·L-1的L-肌肽對細(xì)胞的增殖并無明顯的抑制作用,3、30 mmol·L-1的L-肌肽在一定程度上能有效降低魚藤素對細(xì)胞的增殖抑制作用,尤其是30 mmol·L-1L-肌肽對20 μmol·L-1魚藤素導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制作用的效果最為明顯(細(xì)胞抑制率降低近10%),故采用30 mmol·L-1L-肌肽與20 μmol·L-1魚藤素組進行其他相關(guān)實驗。通過AO/EB實驗和細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),與同濃度的單獨魚藤素組相比,30 mmol·L-1L-肌肽共處理組,細(xì)胞的形態(tài)得到改善,表現(xiàn)為早期凋亡數(shù)減少,說明L-肌肽能夠降低魚藤素對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

      Fig 5 Determination of ROS level of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 h

      采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),30 mmol·L-1L-肌肽共處理組比20 μmol·L-1魚藤素組細(xì)胞的早期凋亡率較小,降低9.35%,同時總凋亡率降低10.7%(P<0.05),故可得知L-肌肽對細(xì)胞的保護作用可能是通過抑制細(xì)胞的凋亡實現(xiàn)的。

      線粒體是氧化應(yīng)激的主要來源之一,因為它利用氧氣作為能量,產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。 ROS通常由緊密調(diào)節(jié)酶產(chǎn)生,如果過度刺激電子傳遞鏈將會導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生。ROS涉及許多疾病,包括線粒體蛋白質(zhì)的改變,線粒體脂質(zhì)和線粒體DNA,這些疾病將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是許多病因的主要原因,包括PD和阿爾茨海默病。研究者發(fā)現(xiàn)幾個與PD有關(guān)的基因涉及到線粒體的功能,神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的原因可能是線粒體功能障礙[10]。Dexter等[11]認(rèn)為,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致PD的主要原因之一。之前研究發(fā)現(xiàn),魚藤素存在神經(jīng)毒性是因為其作用于細(xì)胞的同時,抑制了線粒體復(fù)合體I,線粒體復(fù)合體I被抑制后,電子傳遞鏈將無法進行,導(dǎo)致ROS水平升高[12]。本研究采用DCFH-DA染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組的細(xì)胞ROS水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,30 mmol·L-1L-肌肽組作用于SH-SY5Y細(xì)胞后的 ROS水平較低(P<0.05),其中,30 mmol·L-1L-肌肽和魚藤素共處理組,ROS水平較魚藤素單獨處理組低(P<0.05),表明L-肌肽保護神經(jīng)細(xì)胞毒性的機制可能是通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。

      本研究證實,L-肌肽主要通過抗氧化機制來降低細(xì)胞的神經(jīng)毒性,與魚藤素聯(lián)用時,可以降低魚藤素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,這為進一步研究魚藤素神經(jīng)毒性和尋找降低魚藤素毒性的方法提供了依據(jù)。

      猜你喜歡
      肌肽培養(yǎng)箱批號
      一種JTIDS 信號批號的離線合批方法
      嬰兒培養(yǎng)箱的質(zhì)控辦法及設(shè)計改良探討
      微生物培養(yǎng)箱的選購與管理
      食品工程(2020年3期)2020-01-05 14:38:16
      醫(yī)學(xué)科技期刊中藥品生產(chǎn)批號標(biāo)注探析
      中藥材批號劃分與質(zhì)量管理
      中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:26
      基于模糊PID參數(shù)自整定的細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度控制算法
      肌肽鋅對低鈣性骨質(zhì)疏松籠養(yǎng)蛋雞AKP、BGP及E2的影響
      腦苷肌肽注射液治療2型糖尿病性周圍神經(jīng)病變46例療效觀察
      舒血寧聯(lián)合腦苷肌肽治療血管性癡呆的效果觀察
      “醫(yī)用材料批號監(jiān)控追蹤”質(zhì)量改進及實施評估
      天台县| 浦北县| 昭通市| 盖州市| 阜南县| 钟祥市| 广州市| 门源| 淮阳县| 隆安县| 昌宁县| 成都市| 长岭县| 鄂伦春自治旗| 涿州市| 乳山市| 斗六市| 峨边| 千阳县| 正安县| 巴里| 泾川县| 星座| 巴青县| 连州市| 张家港市| 新建县| 太康县| 托克逊县| 苗栗县| 南宁市| 花垣县| 伽师县| 呼玛县| 南川市| 平南县| 白山市| 榕江县| 澄迈县| 陇川县| 佳木斯市|