李 光，吳 堃，李宜航，呂亞娜，孫慧峰，李學(xué)蘭，孫曉波

(1．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100；2．西雙版納傣藥南藥重點實驗室,云南 景洪 666100; 3．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；4．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100093)

H9c2心肌細胞是上世紀70年代由Kimes等[1]從胚胎期BDIX大鼠心臟組織中分離得到的一種具有骨骼肌特性的心肌細胞株，常用于心血管疾病體外藥效及作用靶點篩選。目前，心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)已成為臨床上影響冠心病患者獲得再灌注最佳療效的主要障礙[2]。H9c2心肌細胞是當(dāng)前研究MIRI的最常用細胞株，用于其作用機制通路的研究[3-4]。研究者常加入H2O2或缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)兩種處理方式，模擬MIRI[4-6]，與加入H2O2相比，H/R處理后H9c2心肌細胞更能夠真實反映心肌缺血/再灌注的損傷過程，故為更多的研究者使用。但實驗過程中，由于使用試劑及儀器的不同，H/R的條件也不盡相同[7-8]。同時，大多數(shù)研究者通過檢測H9c2心肌細胞存活率，作為模型成功的衡量標準，缺乏在H/R過程中對細胞的生長狀態(tài)的檢測，“終點”檢測很難真實反映H/R的損傷過程。

實時阻抗細胞分析(real time cellular analysis, RTCA)技術(shù)是近年來新興的細胞活性檢測方法。該方法是把微電子細胞傳感器芯片整合到表面適于細胞貼附生長的細胞檢測板的底部，細胞在檢測板上的貼壁程度及生長可引起各個電極陣列的電極結(jié)構(gòu)的阻抗變化，該系統(tǒng)可以實時并自動獲取其電阻模擬電信號，并可以轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號以進行分析。因此，電阻抗即反映為細胞指數(shù)(cell index，CI)的值，用于指示細胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡、貼壁程度等生理狀態(tài)。該方法具有實時監(jiān)控、無需標記、全自動化、高靈敏度、高準確性等優(yōu)點，更多應(yīng)用于腫瘤藥物篩選、免疫、藥物毒性檢測等方面[9-10]。本研究基于RTCA技術(shù)，評價在H/R過程中H9c2心肌細胞的損傷過程，以期尋找最佳H/R條件，真實反映H9c2心肌細胞H/R過程中的損傷狀態(tài)，并使用目前研究較多的三七皂苷R1(notoginsenoside R1，NGR1)進行評價，從而建立規(guī)范、標準的造模方法，為MIRI的藥物作用靶點篩選及作用機制研究提供參考。

1 材料

1.1細胞與試劑H9c2心肌細胞，購自中國科學(xué)院昆明細胞庫。胎牛血清(貨號：20151206，武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號：AB217802，HyClone公司)；無糖的DMEM(貨號：1810192，Gibco公司)；NGR1(貨號：110745-201619，中國食品藥品檢定研究院)；細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：1758909，Thermo公司)。

1.2儀器RTCA S16多功能實時無標記細胞分析儀(ACEA Biosciences Inc)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)； Spectramax i3多功能讀板儀(美谷分子儀器有限公司)；NU-4950三氣培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)；C6流式細胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)大鼠H9c2胚胎心肌細胞株置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞貼壁80%～90%時，用0.25%胰酶消化，計數(shù)，以1 ∶3的比例傳代，每2～3 d傳代1次。

2.2MTT實驗用0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集到離心管中混勻。按每孔8 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細胞處理后，每孔加MTT溶液(5 g·L-1) 20 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，離心棄上清，每孔加入100 μL DMSO，震蕩，酶標儀測定490 nm處的吸光度。

2.3RTCA實驗首先在E-Plate板中加入50 μL培養(yǎng)基，測定基線CI值，再加入100 μL細胞懸液，放入RTCA多功能實時無標記細胞分析儀，動態(tài)監(jiān)測細胞黏附伸展及增殖狀況。

2.4H/R實驗取對數(shù)生長期H9c2心肌細胞，接種于96孔板或E-Plate板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育35 h后，在三氣培養(yǎng)箱中H/R處理，檢測細胞生長狀況。

3 結(jié)果

3.1RTCA檢測H9c2心肌細胞增殖狀況分別將4 000、6 000、8 000、10 000個/孔的H9c2心肌細胞接種于E-Plate板中，設(shè)3個復(fù)孔，RTCA檢測細胞增殖狀況。如Fig 1所示，分別接種4 000～10 000個/孔細胞數(shù)，經(jīng)過培養(yǎng)后，大約經(jīng)過100 h可達到平臺期，且更換培養(yǎng)基后，對H9c2心肌細胞的CI值有影響。

Fig 1 Growth curve of H9c2 cardiomyocytes

3.2RTCA檢測不同缺氧時間對H9c2心肌細胞的損傷將8 000個/孔的H9c2心肌細胞接種于E-Plate板中，3個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育35 h后，將三氣培養(yǎng)箱中氧氣濃度調(diào)整為2%，進行缺氧處理，實時記錄細胞狀況。如Fig 2、Tab 1所示，使用完全培養(yǎng)基建模，缺氧后與正常細胞的CI值無差異，隨時間延長(3～5 h)差異明顯(P<0.05)，而無血清、無糖培養(yǎng)基造模后，CI值明顯降低，且缺氧3 h后，CI值下降趨勢不明顯，達到平臺期。因此，可選取3～5 h作為缺氧時間。

3.3RTCA檢測不同復(fù)氧時間對H9c2心肌細胞的損傷將8 000個/孔的H9c2心肌細胞接種于E-Plate板中，3個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育35 h后，將三氣培養(yǎng)箱中氧氣濃度調(diào)整為2%，缺氧4 h后，進行復(fù)氧，實時記錄細胞狀況。如Fig 3所示，當(dāng)進行復(fù)氧處理后，H9c2心肌細胞CI值出現(xiàn)下降趨勢。根據(jù)正常細胞和H/R處理后H9c2心肌細胞中CI值，按公式細胞存活率=CI缺氧/復(fù)氧處理細胞/CI正常細胞，計算經(jīng)H/R處理后H9c2心肌細胞的凋亡率。根據(jù)文獻[11-12]，H/R損傷后細胞活力大概控制在50%左右，由Fig 4可知，經(jīng)過缺氧4 h/復(fù)氧16 h后，H9c2心肌細胞的存活率為(48.82±5.32)%，且細胞凋亡率與復(fù)氧時間存在時間依賴關(guān)系，從而確定H/R模型條件為缺氧4 h，復(fù)氧16 h。

Fig 2 Effect of different hypoxia time on CI value of

Fig 3 Effect of different reoxygenation time on CI value of H9c2 cardiomyocytes after 4 h hypoxia n=3)

Tab 1 Comparison of CI values in each group after

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4MTT法測定H/R處理后H9c2心肌細胞活力將8 000個/孔的H9c2心肌細胞接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育35 h后，將三氣培養(yǎng)箱中氧氣濃度調(diào)整為2%，缺氧4 h后，復(fù)氧16 h，H/R結(jié)束后，MTT法測定細胞活力。如Fig 5所示，使用96孔板測定H/R處理后細胞存活率為(50.72±6.38)%，與RTCA分析結(jié)果差異無顯著性，說明使用RTCA分析H9c2心肌細胞H/R模型的方法比較可靠。

Fig 4 Effect of different reoxygenation time on apoptotic rate of H9c2 cardiomyocytes n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsreoxygenation for 0 h;#P<0.05,##P<0.01vsreoxygenation for 16 h

Fig 5 Survival rate of H9c2 cardiomyocytes

**P<0.01vscontrol

3.5流式細胞術(shù)測定H/R后H9c2心肌細胞活力將105個/孔的H9c2心肌細胞接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育35 h后，將三氣培養(yǎng)箱中氧氣濃度調(diào)整為2%，缺氧4 h后，復(fù)氧16 h，H/R結(jié)束后，流式細胞術(shù)測定細胞活力。如Fig 6所示，利用本實驗方法將H9c2心肌細胞進行缺氧4 h/復(fù)氧16 h處理后，細胞凋亡率(46.17±0.72)%，與RTCA及MTT法測定結(jié)果差異無顯著性，說明RTCA方法可替代MTT及流式細胞術(shù)，評價H9c2心肌細胞H/R模型。

3.6NGR1對H/R處理后H9c2心肌細胞增殖的影響將8 000個/孔的H9c2心肌細胞接種于E-Plate板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育后，加入25 mg·L-1NGR1處理24 h，使用三氣培養(yǎng)箱進行H/R處理，實時記錄細胞狀況。如Fig 7所示，NGR1預(yù)處理H9c2心肌細胞后，H/R處理后，能夠明顯增加細胞CI值，在復(fù)氧8～12 h期間，經(jīng)NGR1處理后，H9c2心肌細胞增殖出現(xiàn)短暫平臺期，隨后以較大斜率進行增殖，表明NGR1促進H/R后H9c2心肌細胞的增殖并非時間依賴性。

**P<0.01vscontrol

Fig 7 Effect of NGR1 on CI value of H9c2 cardiomyocytes after H/R

4 討論

RTCA技術(shù)是一種基于電阻值，實時反映細胞貼壁狀態(tài)的新型觀測細胞增殖的技術(shù)，對于測定細胞毒性，觀察細胞增殖狀況具有明顯的優(yōu)越性。在本研究中，通過RTCA能夠?qū)崟r觀察H/R過程中H9c2心肌細胞狀態(tài)，從而明確H/R條件對H9c2心肌細胞的損傷作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模過程中培養(yǎng)基對于模型影響較大，H/R過程中，完全培養(yǎng)基基本不會引起細胞損傷，使用無血清、無糖培養(yǎng)基才是成模的關(guān)鍵。

目前研究建立H9c2心肌細胞H/R模型一般使用MTT終點法[13-14]，不能夠真實反映H/R細胞損傷的過程，因此出現(xiàn)了H/R條件不同的情況。本研究使用三氣培養(yǎng)箱做為造模工具，盡量減少人為因素干擾，對建立規(guī)范、標準的造模方法具有一定的指導(dǎo)意義，并且具有快速、準確、易操作等優(yōu)點。通過本研究最終確定的成模條件為H9c2心肌細胞培養(yǎng)35 h后，更換無血清、無糖DMEM培養(yǎng)基，在2%氧氣、5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)4 h進行缺氧處理，然后調(diào)整氧氣濃度為21%，相同條件培養(yǎng)16 h，作為復(fù)氧處理。

NGR1對H/R處理后H9c2心肌細胞具有保護作用，相關(guān)研究較多[9, 15]。通過該技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)，NGR1促進H/R處理后H9c2心肌細胞增殖并不存在時間依賴性，而是存在一定的平臺期，然后快速增殖，這有可能是給藥后通過一定的時間積累，激活H9c2心肌細胞中的某些關(guān)鍵因素而促進細胞增殖，其深入機制還有待進一步證實，這也為發(fā)現(xiàn)新藥物靶點和作用機制提供了參考。