幾種菌的外排泵系統(tǒng)及其抑制劑

黃嬌 編譯，穆青 審校

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 200000)

20世紀出現(xiàn)了許多能成功預(yù)防與控制感染性疾病的方法，然而人們卻誤認為對抗感染性疾病的戰(zhàn)爭已經(jīng)結(jié)束。在20世紀80年代，藥企普遍認為貨架上有足夠的抗生素，因此，他們將研究的精力轉(zhuǎn)移至別處。當新的流感病毒爆發(fā)以及耐藥病原菌再次出現(xiàn)時，發(fā)現(xiàn)這種樂觀態(tài)度只是暫時的。超級細菌，即幾乎對所有抗生素產(chǎn)生抗藥性的細菌，對人類健康造成巨大威脅。每年在全世界范圍內(nèi)超過一千三百萬人死于新的感染性疾病或者先前被認為容易控制的二次感染。Christina Kourtesi等在期刊The Open Microbiology Journal, 2013, 7 (Suppl 1-M3): 34-52發(fā)表了題目為Microbial Efflux Systems and Inhibitors:Approaches to drug discoveryand the challenge of clinical implementation的綜述文章，我們通過編譯其前半部分內(nèi)容介紹細菌的外排泵耐藥系統(tǒng)。

多藥外排作用是致使多種抗生素以及化學(xué)治療藥物對細菌無效的一個主要原因。外排作用來源于膜轉(zhuǎn)運蛋白的活性，這種蛋白即為多藥外排系統(tǒng)。多藥外排系統(tǒng)在細胞代謝過程中非常重要，并且在膜拓撲、能量耦合機制以及底物特異性方面的作用各有不同。鑒定天然底物和外排系統(tǒng)抑制劑需要積極而有拓展性的研究課題?；谛蛄械南嗨菩?，外排系統(tǒng)被劃分為以下六個超級家族(圖1)：ATP結(jié)合盒(ABC)、多藥及毒性化合物外排(MATE)、耐藥節(jié)結(jié)化細胞分化家族(RND)、小多重耐藥性家族(SMR)、多種抗生素外排蛋白家族以及多藥核內(nèi)體轉(zhuǎn)運家族(MET)。前5個家族存在于微生物中，而MET家族似乎僅限于高等真核生物。所有家族的代表成員都在哺乳動物細胞中表達。ABC轉(zhuǎn)運體是最大的超級家族，基于其序列及結(jié)構(gòu)的同源性，可將其分為A～G等7個亞家族。

轉(zhuǎn)運底物識別的分子機制、動力學(xué)、化學(xué)計量學(xué)以及反轉(zhuǎn)運的特點是一直在持續(xù)進行的研究領(lǐng)域。結(jié)構(gòu)研究表明，轉(zhuǎn)運體可直接從周質(zhì)或者細胞質(zhì)膜的外部leaflet與底物結(jié)合?；仡櫼幌?，藥物轉(zhuǎn)運過程包括幾個具體的關(guān)鍵步驟，即分子內(nèi)和分子間構(gòu)象變化以及分子間動力學(xué)的相互作用；需要晶體學(xué)、分子建模、分子生物學(xué)、能量計算和生物功能調(diào)查等多方面學(xué)科的協(xié)同作用，才能理解藥物轉(zhuǎn)運過程。由于一些藥物轉(zhuǎn)運蛋白有協(xié)同作用或者能夠按順序發(fā)揮作用，使得這些作用情形顯得更加復(fù)雜。

由于RND以及ABC外排系統(tǒng)在反向轉(zhuǎn)運以及能量依賴性外排方面存在機制差異，有關(guān)RND以及ABC外排系統(tǒng)中的藥物運輸具有根本性的挑戰(zhàn)，即廣泛的特異性或稱多特異性。區(qū)分“單一”結(jié)合步驟以及在具有活性構(gòu)象的高親和力口袋中正確識別結(jié)合很困難，這種結(jié)合可有效地將藥物轉(zhuǎn)運到外膜通道。包括分子對接計算在內(nèi)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)雖然提供了一些信息，但是沒有生物學(xué)支持，遠遠達不到模型開發(fā)的程度。能量來源是運輸功能以及底物識別的關(guān)鍵因素，至少質(zhì)子反轉(zhuǎn)運外排是一個PH依賴過程，這也是研究各種病原體的一個熱門領(lǐng)域。

為了克服外排作用對化學(xué)治療的阻礙，①改進舊的抗生素分子設(shè)計以減少外排以此繞開外排系統(tǒng)。②通過直接修飾減少隔膜功能，或者減少外膜通道造成“交通阻塞”的通道阻滯劑的功效，實現(xiàn)細胞內(nèi)藥物的高濃度貯存。③阻斷外排能力，通過競爭或非競爭抑制，反向轉(zhuǎn)運位點的直接或間接的能量消耗，細菌細胞胞外被膜能量驅(qū)動機制的瓦解。

通過對感染和腫瘤多種靶標提供活性結(jié)構(gòu)骨架，天然產(chǎn)物在藥物發(fā)現(xiàn)中扮演了重要角色。運用天然產(chǎn)物作為外排系統(tǒng)抑制這一戰(zhàn)略出現(xiàn)在近十年。全新的和已知的天然化學(xué)分子實體的活性涵蓋了幾乎所有的主要微生物外排系統(tǒng)，這些報道遍布化學(xué)領(lǐng)域和其它文獻。通過使用外排抑制劑恢復(fù)和提高抗菌素功用是吸引人的，但迄今為止還未進入使用狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)外排抑制劑的努力在多角度和深入展開，但很多概念和方法上的缺口依然阻礙著先導(dǎo)外排抑制劑進入臨床運用。本綜述重點對植物來源的外排泵抑制劑發(fā)現(xiàn)和確證的工具及其特點進行了總結(jié)，同時大致描述了它們的進一步發(fā)展和臨床應(yīng)用發(fā)展之路。

1 革蘭陽性菌中的多藥外排系統(tǒng)

與革蘭陽性菌耐藥性相關(guān)的主要外排系統(tǒng)為染色體編碼的MFS家族，包括NorA，NorB，NorC以及MdeA；MATE家族，如mepRAB(多藥外排蛋白)；SMR家族，如SepA。另外，也存在質(zhì)粒編碼體系，如QacA，QacB以及Tet(K)，這些體系具有四環(huán)素-二價金屬絡(luò)合物/H+反轉(zhuǎn)運體功能。NorA同系物(EmeA)也已經(jīng)在糞腸球菌中得到驗證。這些系統(tǒng)均具有廣泛的、重疊的底物特異性，具體包括喹諾酮，四環(huán)素，單價和二價抗微生物陽離子(插層染料，季銨化合物，聯(lián)脒，雙胍)和植物次生代謝物，見表1。

2 革蘭陰性菌中的多藥外排系統(tǒng)

多重耐藥(MDR)和泛耐藥(PDR)革蘭陰性菌使得感染真正無法治愈，對人類生命構(gòu)成了嚴重的威脅。外排系統(tǒng)是各種具有挑戰(zhàn)性的臨床感染的關(guān)鍵角色。耐藥-節(jié)結(jié)化細胞分化家族(RND)包括在大腸埃希菌中以AcrAB-TolC為主要成員的質(zhì)子驅(qū)動系統(tǒng)，它們在弗氏木蘭弧菌(Francisella tularensis)、耶爾森菌(Yersinia pestis)和布魯桿菌(Brucella)屬中具有強同源性，AcrB是與外膜通道TolC和膜融合蛋白AcrA相關(guān)聯(lián)的多亞單位復(fù)合物。在銅綠假單胞菌中存在12種RND型外排系統(tǒng)，其中MexAB-OprM，MexCD-OprJ和MexXY-OprM已被證明對β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類有耐藥性(另外還有MexEF-oprN)。雖然已經(jīng)建立了與氨基糖苷類抗生素、抗菌肽和生物膜形成相關(guān)的耐藥外排劃分體系，但是這只是復(fù)雜的細胞反應(yīng)的一部分。最近分析了新增加的RND類型系統(tǒng)的特點，包括MexABC-OpmB和一種三氯生外排泵TriABCOpmH(MexABC-OpmB和TriABC-OpmH均為新增加的RND類型系統(tǒng))。銅綠假單胞菌中的mex-locci與3個關(guān)鍵病原體的同源系統(tǒng)具有系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性。

圖1 微生物外排系統(tǒng)中5個超級家族關(guān)鍵成員的示意圖

2.1 Bpe-外排系統(tǒng)

伯氏假單胞菌(Bulkhoderia pseudomallei)以及鼻疽伯克霍爾德菌(B.mallei)中的11個Bpe-外排系統(tǒng)。BpeAB-OprB是一種廣譜多藥外排系統(tǒng)，僅在低水平表達，只對多重耐藥有微弱的貢獻。相反，表達BpeEF-OprC的菌株對于大多數(shù)臨床有用的抗瘧疾抗生素具有高度抗藥性。

2.2 Bme-外排系統(tǒng)

存在于新洋蔥伯克霍爾德菌(B.cenocepacia)中的16種RND外排系統(tǒng)(Bcc復(fù)合物，RND-1至-16)以及脆弱擬桿菌中的Bme(ABC1-16)。至少有七種BmeB外排泵在轉(zhuǎn)運抗微生物藥物方面起著重要作用，并且具有相互交疊的底物，另外至少有四種具有固有抗藥性。

2.3 Ade RND系統(tǒng)以及ABC外排系統(tǒng)

在鮑曼不動桿菌中至少有5種Ade RND系統(tǒng)具有完全的功能特征，其中包括AdeIJK，AdeSR-adeABC，AdeDE和AdeFGH。

ABC外排系統(tǒng)已經(jīng)在多種情況下被證實，包括黏質(zhì)沙雷菌中的雜二聚體SmdAB和大腸埃希菌大環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)運體MacAB，MacAB在尼日利亞淋病中也得到了驗證。

一些具有外排能力的MFS存在于革蘭陰性菌，其中包括腸系膜沙門菌Typhimurium SmvA基因，(極其類似于金黃色葡萄球菌的QacA)，大腸埃希菌的EmrAB-TolC以及在大腸埃希菌和克雷伯菌[44]中涉及喹諾酮耐藥性的QepA和OqxAB質(zhì)粒，但MFS在腸桿菌科中分布廣泛。鮑曼不動桿菌中的外排泵CraA與大腸埃希菌的MdfA同源，氯霉素和獲得性窄譜系統(tǒng)TetA，TetB，CmlA和FloR對鮑曼不動桿菌中的CraA無效。AmvA調(diào)節(jié)著鮑曼不動桿菌對抗菌和消毒作用的耐藥性。SMR和MATE家族的成員已經(jīng)在各種革蘭陰性菌中被檢測到。AbeM和AbeS已經(jīng)在鮑曼不動桿菌中確定特征，不動桿菌屬其它種的AdeXYZ，AdeDE和QacE也是如此，SugE在陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)中具有抗菌素耐藥性，見表2。

3 分枝桿菌中的多藥外排系統(tǒng)

分枝桿菌復(fù)合物具有相當多樣化的外排系統(tǒng)，它們是MFS或者ABC超級家族成員。相比于基因組大小，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)被公認為是具有最大的藥物外排泵數(shù)量的菌種之一。生物信息學(xué)以及直接和間接證據(jù)已經(jīng)確定了藥物外排與結(jié)核分枝桿菌固有耐藥性或者獲得耐藥性之間的關(guān)系。Tap是第一個鑒定出的MFS系統(tǒng)，Rv1258在結(jié)核分枝桿菌基因組的注釋序列中。已經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)運蛋白與其他生物組織鑒定出的蛋白質(zhì)之間的基因組分析和同源檢索，揭示了屬于MFS的編碼公認的藥物外排泵的16個開放閱讀框，包括序列Rv0849在內(nèi)至少三個被證明有藥物外排功能。這一列表正在擴展，包括ABC超家族成員，如DrrAB、Bcg0231(牛分枝桿菌BCG)、Rv0194、Rv1218c、Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c和SMR系統(tǒng)Rv3065，恥垢分枝桿菌中的LfrA，以及結(jié)核分枝桿菌的同源物Rv1145、Rv1146、Rv1877、Rv2846c(efpA)和在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌中的Rv3065(mmr和emrE)。

表1 臨床常見革蘭陽性菌的外排系統(tǒng)

表2 臨床常見革蘭陰性菌和結(jié)核桿菌的外排系統(tǒng)

4 真菌中的多藥外排系統(tǒng)

真菌多藥外排系統(tǒng)得以最好研究的家族來自釀酒酵母，特別是那些多效藥耐藥(PDR)菌株。這個家族的成員是高度保守的，并且通常是致病真菌物種產(chǎn)生耐藥性的來源。雖然真菌細胞含有兩種類型系統(tǒng)的許多基因，一類為管家基因，一類為奢侈基因，但臨床唑類耐藥性通常與ABC轉(zhuǎn)運體的過度表達有關(guān)。臨床上重要的PDR轉(zhuǎn)運體包括白念珠菌Cdr1p(CaCdr1p)和CaCdr2p，它們是釀酒酵母Pdr5p(ScPdr5p) 和哺乳動物G型ABC轉(zhuǎn)運體的同系物。真菌PDR外排系統(tǒng)具有相對較雜的底物特異性，可能是由于其跨膜結(jié)構(gòu)域的底物特異性。通過分析白色念珠菌基因組鑒定了幾種屬于ABC超家族的外排泵(CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、SNQ2和YOR1)。表1和表2列舉了一些臨床常見的幾種菌的外排系統(tǒng)。

5 結(jié)語

由于抗生素的濫用，細菌對臨床所使用的幾乎所有抗生素產(chǎn)生了耐藥性，新的抗菌藥物的研發(fā)越來越具有挑戰(zhàn)性，因此，如何應(yīng)對耐藥菌感染是目前亟需解決的一大難題。研究表明，由外排泵介導(dǎo)的耐藥性較為普遍，且大部分外排泵在結(jié)構(gòu)上具有同源性，有助于發(fā)現(xiàn)對不同細菌的不同外排泵具有廣泛抑制作用的外排泵抑制劑。另外，細菌外排泵的種類繁多，作用機制復(fù)雜，因此需要對細菌外排泵的結(jié)構(gòu)以及作用機制等進行深入研究，以克服細菌耐藥性，將外排泵抑制劑與抗生素聯(lián)用的策略提高抗生素的效用。