屈紅林，謝 軍，陳嘉勤，劉瑞蓮，湯長發(fā)，陳伊琳，陳 偉，李 娣，彭 琪，陳 銳

（1．湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院 湖南省體適能與運(yùn)動康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙420012；2．宜春學(xué)院 體育科學(xué)研究所，江西 宜春336000）

抑郁癥（Depression）是一種與腦內(nèi)海馬調(diào)控情緒與心境障礙密切相關(guān)的炎癥性疾病，表現(xiàn)為長時(shí)間的情緒低落和典型的“三高三低”（高患病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和低檢出率、低就診率、低治愈率），嚴(yán)重者可導(dǎo)致自殺或擴(kuò)大性自殺，已成為21世紀(jì)人類的主要?dú)⑹趾屠_全球最為嚴(yán)重的健康問題（Solhaug et al.,2012）。前期研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織炎癥作用在抑郁癥的進(jìn)程中起至關(guān)重要的作用（屈紅林 等,2008,2018）。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain like protein 3，NLRP3）炎性體是介導(dǎo)人體固有免疫的重要蛋白，是炎性體組成的核心成分，在許多疾病的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。NLRP3可通過識別相關(guān)分子模式，結(jié)合配體被激活，誘導(dǎo)NLRP3炎性體的組裝，促使pro-caspase1蛋白發(fā)生自身蛋白水解切割成具有生物活性的半胱氨酸天冬酰胺特異蛋白酶-1（Caspase-1），促使下游的（Interleukin，IL）IL-1β和IL-18前體成熟，生成具有生物活性的IL-1β和IL-18（吳雨卉 等,2018; Man et al.,2015），分泌至胞外，發(fā)揮炎性效應(yīng)（He et al.,2015），參與多種炎癥疾病的發(fā)病過程（張濤 等,2015; Xu et al.,2016）。TLR4參與抑郁癥的炎癥過程已經(jīng)得到證實(shí)（Yan et al.,2011; Cheng et al.,2016），其可通過增加 NLRP3和 Pro-IL-1β的表達(dá)誘發(fā)炎性體（Latz et al.,2013）。然而，TLR4/NLRP3在海馬組織中的作用及其與抑郁癥的潛在關(guān)系是否參與抑郁癥的發(fā)病過程，仍未得到充分的證實(shí)（甄鳳亞 等,2017; Mcneela et al.,2010）。

miRNA是內(nèi)源基因編碼長度約為 18～24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA（Camkurt et al.,2017），主要在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，被稱為細(xì)胞過程的“主要調(diào)節(jié)因子”（Sun et al.,2010）?，F(xiàn)已有多種miRNAs在抑郁癥的研究中顯示出生物標(biāo)志物的多潛能性，其中，miR-223就是最主要的 miRNAs之一（Camkurt et al.,2015）。盡管TLR信號傳導(dǎo)調(diào)控miRNA已經(jīng)得到很好的證實(shí)，NLRP3可由TLR誘導(dǎo)，但miRNA是否參與到NLR蛋白及其炎性體的調(diào)控過程？Haneklaus等（2012）的研究發(fā)現(xiàn)，miR-223的過表達(dá)可通過靶向 NLRP3的 3’-非翻譯區(qū)（UTR）的保守結(jié)合位點(diǎn)病毒阻止 NLRP3表達(dá)，轉(zhuǎn)化為降低 NLRP3炎性體活性，限制炎性體激活，抑制炎性體中 IL-1β等的產(chǎn)生。Yang等（2015）的研究也驗(yàn)證了 miR-223可下調(diào)NLRP3，并通過Caspase-1和IL-1β抑制炎癥反應(yīng)，改善腦神經(jīng)功能，并提出 miR-223有可能成為一種降低炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn)。Bauernfeind等（2012）考慮到miR-223作為NLRP3炎性體信息轉(zhuǎn)錄控制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，將 miR-223作為控制NLRP3炎性體活性的重要“變阻器”。Wang等（2014）的研究也顯示，miR-223除了調(diào)控NLRP3等炎性相關(guān)靶點(diǎn)因子外，還靶向作用于NF-κB激活劑、TNF-a受體及配體以及干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF4）等，靶向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。Camkurt等（2015）對50名抑郁癥患者和41名健康人的研究顯示，miR-223在抑郁癥患者外周血中的表達(dá)顯著高于正常人，呈顯著性差異。以上研究雖然報(bào)道了miR-223通過下調(diào) NLRP3參與炎癥調(diào)控，抑制炎性因子的差異表達(dá)，在多數(shù)炎癥疾病中發(fā)揮作用，但針對該調(diào)控機(jī)制在抑郁癥患者方面的研究報(bào)道并不多見，尤其是在海馬組織細(xì)胞中通過什么樣的途徑調(diào)節(jié) NLRP3的表達(dá)，以及經(jīng)miR-223調(diào)控后的穩(wěn)定性等，知之甚少。

適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動能夠改善機(jī)體的抗炎能力，其功能涉及多種病理生理過程，如改善胰島素抵抗（吳秀琴 等,2016;劉敏 等,2015），減輕動脈粥樣硬化（吳衛(wèi)東 等,2016），降低心肌組織抑炎因子（李紅葉,2017），改善代謝綜合征炎癥反應(yīng)（王卉 等,2017），抗骨性關(guān)節(jié)炎（高丕明 等,2015），促進(jìn)阻塞性黃疸致肝損傷修復(fù)（郭音 等,2017）等。值得注意的是，新近的研究表明，有氧運(yùn)動在各種神經(jīng)退行性疾病，包括老年癡呆（含阿爾茨海默?。ㄌ泼?等,2017;李小龍,2016）、帕金森?。ˋfshari et al.,2017;Playford,2011;Subramanian,2017）、慢性腦缺血（陳偉 等,2017）、大鼠海馬 Aβ沉淀（張憲亮,2016）、腦卒中（溫如武 等,2018）等起著重要的抗炎效果。杜杰等（2017）證明，間歇和連續(xù)的有氧運(yùn)動可在一定程度上抑制 IKKβ/NF-κB炎癥通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，改善機(jī)體炎癥反應(yīng)。周期性、中低強(qiáng)度的有氧運(yùn)動有助于降低糖尿病患者炎癥因子Chemerin水平（林小晶 等,2017）。戈含笑等（2017）的研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動可通過調(diào)節(jié)血清皮質(zhì)酮的表達(dá)降低海馬內(nèi)前炎性因子的釋放，還可激活 CREB、BDNF及 ERK等信號蛋白的表達(dá)，提高神經(jīng)營養(yǎng)作用，保護(hù)神經(jīng)免受損傷，增加神經(jīng)可塑性和神經(jīng)發(fā)生來發(fā)揮抗抑郁作用。董秀娟等（2017）研究提示，跑臺運(yùn)動可通過下調(diào) miR-483對IGF2表達(dá)增強(qiáng)的調(diào)控作用，有效促進(jìn)海馬神經(jīng)元的存活，改善學(xué)習(xí)記憶功能。近期的一項(xiàng)研究表明，游泳運(yùn)動通過誘導(dǎo)炎癥/IDO通路的激活，抑制腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)改善抑郁癥狀（Liu et al.,2013）。Radomaizik等（2010）的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動不僅會刺激中性粒細(xì)胞中的基因表達(dá)，還會通過miRNA調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯和細(xì)胞功能影響細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)過程，尤其是運(yùn)動會誘導(dǎo) miR-223的表達(dá)水平增加，并負(fù)調(diào)節(jié)祖細(xì)胞增殖與粒細(xì)胞分化等過程，發(fā)揮抗炎作用。雖然這些研究表明，有氧運(yùn)動可能通過調(diào)節(jié)海馬組織中的炎性信號通道的抗炎和/或促炎作用在抑郁癥的發(fā)病過程中發(fā)揮作用，但運(yùn)動能否通過干預(yù)和調(diào)控miRNA與炎性細(xì)胞因子間的相互作用參與抑郁癥的病理過程，尤其是 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸在運(yùn)動干預(yù)抑郁癥方面發(fā)揮怎么樣的調(diào)控作用，此類相關(guān)研究鮮見實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本課題組首先對造模效果進(jìn)行了評定，然后進(jìn)行海馬組織的 miRNA與mRNA的高通量測序及關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，TLR4/NLRP3與 miR-223間存在一定的相關(guān)性，且這種關(guān)系與有氧運(yùn)動的干預(yù)高度相關(guān)，為此，課題組以炎性信號通道TLR4/NLRP3與 miR-223間的相互關(guān)系擬定實(shí)驗(yàn)研究方案，并采用免疫組化、Western Blot和RT-qPCR等方法予以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要試劑：DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，生化試劑購于鋆 大生物科技（上海）有限公司、Trizol購于 Inventragtion，ELISA進(jìn)口試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 TAKARA、兔抗多克隆抗體 IL-1β、IL-10、NF-κB、TLR4等購于 ABclonal，mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成、miR-223引物由Ribobio設(shè)計(jì)與合成、TLR4的抑制劑TAK-242購自MedChemExpress。

主要儀器：BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)、YT-6C生物組織攤烤片機(jī)、LEICA RM2126輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、DHG9000烘烤箱、Bio-Rad電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、Tanon Multi凝膠成像系統(tǒng)、CKX31奧林巴斯倒置顯微鏡、Microfuge低溫高速離心機(jī)、T10 Basic高速組織勻漿機(jī)、ThermoFisher酶標(biāo)儀、Biorad CFX96Touch PCR儀、Q5000超微量分光光度計(jì)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及CUMS抑郁小鼠模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)動物及分組：C57BL/6小鼠（20±3 g，雄性，8周齡）60只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供（許可證號：SCXK湘 2016-0002），所有小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的動物房（溫度 22℃±1℃，濕度 55%±5%），自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)處理取材前12 h禁食過夜。將小鼠隨機(jī)分為空白對照組（CG）、模型對照組（MG）、模型運(yùn)動組（ME）、TLR4抑制劑組（TG）、TLR4抑制劑+運(yùn)動組（TE），共5組，12只/組。

慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）抑郁小鼠模型制備：除空白對照組外的其余小鼠，按照 13種慢性應(yīng)激刺激因子（晝夜調(diào)整、光照性質(zhì)改變、禁食、禁水、噪音、傾斜鼠籠、潮濕墊料、束縛、水平震蕩、冰水游泳、高溫游泳、輕夾鼠尾、間斷閃光刺激），進(jìn)行為期28天的慢性應(yīng)激性刺激造模（洪燈 等,2011）。13種慢性應(yīng)激刺激因子按照隨機(jī)數(shù)字法生成28天的慢性應(yīng)激性刺激方案，每天刺激1～2種，為防止小鼠產(chǎn)生適應(yīng)反應(yīng)，確保相鄰兩天實(shí)施不同的刺激。

1.3 TLR4抑制劑及其模型制備

借鑒文獻(xiàn)資料，實(shí)驗(yàn)選取 TAK-242作為 TLR4的抑制劑。造模成功后的TG組和TE組小鼠借鑒夏曉爽等（2016）的實(shí)驗(yàn)劑量0.3 mg/kg體重進(jìn)行腹腔注射，5次/周，共4周。

1.4 CUMS抑郁小鼠運(yùn)動方案

造模后的ME組和TE組小鼠實(shí)施中等強(qiáng)度的有氧跑臺運(yùn)動刺激，借鑒 Bedford（1979）運(yùn)動方案進(jìn)行改良，即按照跑臺坡度0°，速度為10 m/min，第1周進(jìn)行遞增負(fù)荷的適應(yīng)性訓(xùn)練，按照每天遞增10 min，共訓(xùn)練6天，第2周開始正式訓(xùn)練10 m/min，60 min/天，6 天/周，連續(xù)訓(xùn)練8周，所有的訓(xùn)練均安排在9:00—11:30進(jìn)行。

1.5 CUMS抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)評定結(jié)果

為評價(jià) CUMS抑郁造模與運(yùn)動干預(yù)效果，本研究針對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行了強(qiáng)迫游泳、強(qiáng)迫懸尾、糖水偏好等神經(jīng)行為學(xué)評定。

強(qiáng)迫游泳：將受試小鼠放入裝有溫水（25℃±1℃）的圓形燒杯，直徑10 cm，水深10 cm，ANC酷睿HD1080P高清攝像頭記錄小鼠6 min內(nèi)不動狀態(tài)潛伏期和后4 min內(nèi)不動狀態(tài)持續(xù)時(shí)間。

強(qiáng)迫懸尾：采用懸尾箱、周壁及底部均為黑色，箱體頂部由25 W白熾燈照明，采用V11.60.00正版監(jiān)控軟件錄像，記錄小鼠6 min內(nèi)不動狀態(tài)潛伏期和后4 min內(nèi)不動狀態(tài)持續(xù)時(shí)間。

糖水偏好實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練小鼠適應(yīng)含糖飲水，測試前所有小鼠禁水過夜后（禁水時(shí)間10 h以上），每只小鼠隨機(jī)放置事先稱重過的純水瓶1個和含有1%的蔗糖水水瓶1個，0.5 h后，調(diào)換兩只水瓶的相對位置，記錄單只小鼠在1 h內(nèi)的糖水消耗量和純水消耗量，按照糖水偏好率=糖水消耗/（糖水消耗+純水消耗）×100%，計(jì)算單只小鼠糖水偏好率。

1.6 樣本處理及ELISA指標(biāo)檢測

8周有氧運(yùn)動結(jié)束當(dāng)日，所有小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。禁食過夜，次日每組隨機(jī)選取6只實(shí)驗(yàn)小鼠，1%的戊巴比妥鈉麻醉（50 mg/kg）后，快速開胸，2 ml的真空抗凝管自心臟抽取新鮮血液，冷凍離心提取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書ELISA法測定血清中IL-1β和IL-10的含量。

處死后的小鼠于冰上剝離頭部毛發(fā)與皮膚，暴露顱骨，用眼科鑷自枕骨大孔輕輕剝開顱骨，充分暴露腦組織，直鑷小心向上剝開大腦左右皮層，暴露出整個海馬組織，玻璃分針將海馬組織與大腦皮層及周圍的腦組織分開，取出海馬組織，冰PBS液沖洗，濾紙吸掉多余水分，稱重后于Trizol試劑中浸泡，-80℃冰箱凍存，用于RNA的提取。

1.7 病理改變與免疫組織學(xué)分析

8周的運(yùn)動干預(yù)后，每組隨機(jī)選取3只小鼠，進(jìn)行在體腦固定灌注，待小鼠四肢僵硬，肝臟變白，腦組織變白變硬后，采用上述方法取全腦于 4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，沿冠狀面切成6 μm厚的切片。尼氏染色觀察小鼠海馬尼氏體的病變。SABC法（avidin-biotin-peroxidase complex technique）按試劑說明書進(jìn)行染色，以顯示各因子的陽性表達(dá)。每個切片鏡下（×400）隨機(jī)選取5個視野，利用Simple PCI生物顯微鏡分析圖像體系計(jì)算視野的陽性表達(dá)區(qū)域面積。

1.8 海馬總RNA的提取

首先電動勻漿機(jī)在 Trizol中勻漿后，離心，室溫下靜置 10 min充分裂解，嚴(yán)格按照試劑盒說明書和總 RNA提取依次滴加試劑、離心，提取總 RNA。提取的總 RNA經(jīng)Q5000超微量分光光度計(jì)測定其含量及RNA純度。

1.9 海馬組織miRNA與mRNA高通量測序的GO和KEGG功能富集關(guān)聯(lián)分析

針對 miRNA與 mRNA測序分析設(shè)置相同比較組合的幾組進(jìn)行 miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析，從比較的轉(zhuǎn)錄組分析得出差異基因，miRNA分析中得到差異 miRNA及對應(yīng)的靶基因，并進(jìn)行miRNA和mRNA的整合分析，再根據(jù)miRNA與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，對其集合進(jìn)行GO（Gene Ontology）與KEGG富集分析。因考慮到miRNA會抑制甚至沉默其作用的靶基因的表達(dá)，分別按照差異 miRNA與差異 mRNA、差異下調(diào)miRNA與差異上調(diào)mRNA、差異上調(diào)miRNA和差異下調(diào)mRNA 3種情況進(jìn)行差異表達(dá)的miRNA的靶基因集合（或稱為“候選靶基因”）GO與KEGG功能富集分析。

1.1 0 RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照說明書使用高容量的 cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。使用PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time kit定量檢測 NLRP3、TLR4、IL-1β、IL-10和 NF-κBmRNA的表達(dá)水平，One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 SYBR Green PCR Master Mix Kit（Applied biosystems）PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄與定量miR-223的水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用CFX Connect PCR系統(tǒng)（Bio Rad，USA）進(jìn)行 40個循環(huán)的 PCR，GAPDH和U6作為內(nèi)部參照。根據(jù)Gene Bank核酸數(shù)據(jù)庫中神經(jīng)組織各因子 cDNA 序列，NLRP3、TLR4、IL-1β、IL-10和 NF-κBmRNA基因引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，miR-223、U6亦按照 miRBase database數(shù)據(jù)庫中的堿基由廣州Ribobio生物科技有限公司提供（引物合成序列詳見表 1）。PCR檢測過程每樣本設(shè) 3個重復(fù)，測試結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算組織中基因表達(dá)水平。

表1 本研究引物序列表Table 1 The Primer Sequence of Target Genes

1.1 1 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）

另外隨機(jī)選取 3只小鼠，麻醉處死后按上述 1.6的方法取出海馬組織，濾紙吸去其表面水分，稱重，眼科剪剪碎后于高速組織勻漿機(jī)冰上勻漿，4℃12 000 g離心5 min，吸取上清液，酶標(biāo)儀測定其蛋白濃度后，將100 μg/孔的蛋白質(zhì)樣品裝入5%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，轉(zhuǎn)移到0.45 μm孔徑的硝酸纖維素膜（NC膜）上，隨后用溶于 PBS中的3%（W/V）脫脂牛奶的 TBST封閉 2 h。TLR4、IL-1β和IL-10等與4℃的TBST緩沖液中以1:1 000稀釋過夜。然后TBST洗滌5次，每次5 min，并在室溫下與顯色劑綴合的抗兔IgG二抗（稀釋倍數(shù)1:2 000～5 000）孵育1 h。βactin為內(nèi)參。使用Tanon 3500凝膠成像系統(tǒng)通過測定色譜帶強(qiáng)度（區(qū)域×OD）定量Western印跡條帶。

1.1 2 統(tǒng)計(jì)分析

本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，在進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的方差齊性的Bartlett檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素ANOVA方差分析，組間差異按照配對樣本 t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CUMS抑郁造模及其效果評價(jià)

神經(jīng)行為學(xué)評定結(jié)果顯示，MG組小鼠的糖水偏好指數(shù)顯著下降、強(qiáng)迫游泳與懸尾不動時(shí)間明顯延長（表 2）。尼氏染色的結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，錐體細(xì)胞排列紊亂且細(xì)胞形態(tài)皺縮不完整，核固縮并多見偏移，著色淺染，部分尼氏體溶解并消失，胞質(zhì)呈蒼白色（圖 1）。ELISA測試結(jié)果顯示，MG組小鼠血清指標(biāo)的炎性相關(guān)因子如 IL-1β比對照組呈顯著性升高（表 3），IL-10也顯著性增加，說明 CUMS抑郁造模后的小鼠炎癥反應(yīng)較為明顯。由此可以驗(yàn)證 CUMS抑郁造模方法成功誘導(dǎo)出小鼠的抑郁癥狀。

表2 CUMS抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)評定結(jié)果Table 2 The Results of NeurobehavioralAssessment of CUMS Depression Mice(n=8)

表3 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS抑郁小鼠血清ELISA指標(biāo)檢測結(jié)果Table 3 The Results of Serum ELISA Indicators after AerobicTraining in CUMS Depression Mice(n=6, pg/mL)

2.2 CUMS抑郁小鼠高通量測序的GO與KEGG功能富集關(guān)聯(lián)分析

依據(jù)miRNA與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，本研究對每組差異表達(dá)的miRNA的靶基因的集合分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析。基于 miRNA對 mRNA的轉(zhuǎn)錄作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制（圖 2），miRNA會抑制甚至沉默其作用的靶基因。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，miR-223的差異上調(diào)負(fù)調(diào)控 NLRP3的表達(dá)。

圖1 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS抑郁小鼠海馬尼氏染色結(jié)果Figure 1. The Nissl Staining Results in Hippocampus of CUMS Depression Mice after Aerobic Training

圖2 Cytoscape分析miRNA-mRNA差異表達(dá)分析關(guān)系及差異靶基因集的聚類Figure 2. The miRNA-mRNA Differential Expression Analysis Relationship and the Clustering Map of Differential Target Gene Sets by Cytoscape Analysis

2.3 CUMS抑郁誘導(dǎo)小鼠 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸的改變增加海馬炎癥

免疫組化檢測結(jié)果顯示（表 4），與 CG組相比，MG組小鼠海馬組織的IL-1β、NF-κB與TLR4等促炎因子的量比CG組顯著增高（P＜0.01），抑炎因子IL-10也顯著增高（P＜0.05）。鏡下觀察，CG組神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)規(guī)整；MG組與之相比，炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞排列松散，有明顯的溶解破壞現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)不清晰，有的形成空泡（圖3）。

表4 CUMS抑郁小鼠造模前后海馬組織IL-1β、IL-10、TLR4、NF-κB免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)Table 4 The Results of Immunohistochemical Staining of IL-1β, IL-10, TLR4 and NF-κB in Hippocampus(n=6)

圖3 CUMS抑郁小鼠免疫組化檢測結(jié)果Figure 3. The Immunohistochemical Test Results of CUMS Depression Mice(×400)

利用 Western Blot和 RT-PCR方法進(jìn)一步探討有氧運(yùn)動對 CUMS抑郁小鼠海馬炎性相關(guān)因子表達(dá)的影響（耿元文 等,2018;林琴琴 等,2017）。結(jié)果顯示，CUMS抑郁小鼠海馬組織IL-1β、NF-κB和 TLR4的 mRNA均顯著增加，預(yù)示 CUMS抑郁小鼠海馬組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)較為明顯。miR-223的RT-PCR檢測結(jié)果也顯示，MG組高于CG組呈顯著性差異（圖4）。

圖4 各組小鼠海馬NLRP3、TLR4、IL-1β、IL-10、NF-κB與miR-223基因表達(dá)Figure 4. The Gene Expression Maps of NLRP3, TLR4, IL-1β, IL-10, NF-κB and miR-223 in Hippocampus

2.4 有氧運(yùn)動調(diào)控 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸的表達(dá)拮抗抑郁小鼠海馬炎癥反應(yīng)

2.4.1 有氧運(yùn)動拮抗CUMS抑郁小鼠海馬炎癥效果

由表2的檢測結(jié)果來看，對比MG組，ME組小鼠的強(qiáng)迫游泳和強(qiáng)迫懸尾不動時(shí)間得到顯著改善，糖水偏好指數(shù)也有較大幅度的提高，ME組小鼠雖然也有少量神經(jīng)元形態(tài)皺縮不完整，但錐體細(xì)胞排列紊亂得到改善，部分尼氏體更加飽滿，核固縮現(xiàn)象明顯減少，整體來看，有較大幅度的提高，完整的神經(jīng)元數(shù)目顯著增多。ELISA測試結(jié)果顯示，與 MG組相比（表 3），ME組小鼠血清中的促炎因子TLR4、NF-κB和IL-1β下降，抑炎因子IL-10升高，均呈顯著性差異。

免疫組化檢測結(jié)果顯示（表 4），ME組小鼠海馬組織的IL-1β、NF-κB和TLR4等促炎因子的陽性表達(dá)區(qū)域明顯減少，抑炎因子 IL-10的蛋白陽性表達(dá)區(qū)域增多。與 CG組小鼠相比，雖然炎性因子的表達(dá)未完全一致，但已表現(xiàn)出較好的改善趨勢。鏡下觀察可見，ME組、TG組和 TE組，促炎因子表達(dá)量下調(diào)，抑炎因子表達(dá)量上調(diào)，且細(xì)胞排列比 MG組整齊，結(jié)構(gòu)更趨于規(guī)整，在模型組中出現(xiàn)的空泡及溶解破壞現(xiàn)象也得以改善（圖 5）。表明，有氧運(yùn)動改善了抑郁小鼠海馬組織細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖5 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS抑郁小鼠免疫組化檢測結(jié)果Figure 5. The Immunohistochemical Test Results of CUMS Depression Miceafter Aerobic Training (×400)

2.4.2 有氧運(yùn)動激活TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸的差異表達(dá)調(diào)控海馬炎癥反應(yīng)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，MG組 NLRP3和TLR4等炎性因子均表達(dá)上調(diào)，而有氧運(yùn)動可有效逆轉(zhuǎn)，顯著下調(diào)其mRNA表達(dá)。雖然MG組中抑炎因子IL-10 mRNA表達(dá)有所上調(diào)，但有氧運(yùn)動可顯著增加其表達(dá)，與之相比雖然不呈顯著性差異，但其上調(diào)趨勢明顯。Western Blot的檢測結(jié)果證實(shí)，經(jīng)有氧運(yùn)動干預(yù)的 CUMS小鼠海馬中炎性因子IL-1β與NLRP3顯著下降（P＜0.05），TLR4呈顯著性下降（P＜0.01），NF-κB雖不呈顯著性下降，但下降趨勢明顯，說明有氧運(yùn)動能夠降低 CUMS抑郁小鼠海馬組織的炎性反應(yīng)。miR-223的RT-PCR檢測結(jié)果顯示，ME組小鼠海馬組織miR-223的表達(dá)水平顯著高于CG組與MG組（P＜0.01），ME組 NLRP3表達(dá)顯著低于 MG組（P＜0.05），這可能與miR-223特異性靶向作用NLRP3 mRNA的3’-UTR區(qū)，抑制NLRP3的翻譯表達(dá)有關(guān)（Bauernfeind et al.,2012）。

2.5 TLR4抑制聯(lián)合有氧運(yùn)動激活抑郁小鼠TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸進(jìn)而抑制海馬炎癥反應(yīng)

TG組的測試結(jié)果顯示，TLR4被抑制后的抑郁小鼠血清炎性因子TLR4與NF-κB較MG組有顯著性降低，這可能與TLR4抑制劑能夠有效地部分抑制小鼠機(jī)體TLR4的分泌有關(guān)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，TG組小鼠海馬組織的炎性細(xì)胞因子除 TLR4有較大幅度降低外，其余因子均高于CG組，低于 MG組，與此對比，TE組小鼠的促炎因子顯著降低，抑炎因子IL-10明顯升高。Western Blot檢測也驗(yàn)證了這一結(jié)果，TG組小鼠炎性因子的表達(dá)情況低于 MG組，且 NLRP3的降低呈顯著性，TLR4被抑制后再進(jìn)行有氧運(yùn)動康復(fù)訓(xùn)練能進(jìn)一步降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，說明有氧運(yùn)動可加強(qiáng) TLR4抑制劑抗 CUMS抑郁小鼠海馬組織炎癥作用。

3 討論

3.1 CUMS抑郁小鼠激活海馬 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸誘發(fā)炎癥

臨床試驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，炎性因子 IL-1β、IL-18是導(dǎo)致抑郁癥的關(guān)鍵因素（Dunn et al.,2005;Charles et al.,2006），Haapakoski等（2016）的研究指出，免疫系統(tǒng)被激活以及炎性細(xì)胞因子可能參與了部分抑郁癥患者的發(fā)病。NLRP3在機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，NLRP3的失衡可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過量生成，并通過下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)一系列炎癥瀑布反應(yīng)，參與多種炎癥疾病的發(fā)生與發(fā)展（Arend et al.,2008）。張懿（2016）研究結(jié)果顯示，NLRP3可能成為免疫激活和抑郁癥發(fā)生之間關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子，在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，其可通過調(diào)控 IL-1β的表達(dá)參與應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的發(fā)生。本研究結(jié)果中，MG組小鼠 TLR4、NLRP3、IL-1β、NF-κB等炎性相關(guān)的因子的升高與miR-223的表達(dá)上調(diào)，可能與 TLR4前導(dǎo)基因的高表達(dá)有關(guān)，miR-223介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因NLRP3的表達(dá)，即TLR4識別配體后，可激活下游包括NF-κB在內(nèi)的炎性信號通路，miR-223可通過靶向識別 IKKα調(diào)控 TLR4/NF-κB信號通路（Li et al.,2010），進(jìn)一步誘發(fā) IL-1β、IL-18等炎性信號因子前體促使 NLRP3炎癥體活化，伴隨 NLRP3的活化，IL-1β與IL-18等炎癥因子的前體轉(zhuǎn)化成成熟的IL-1β和IL-18，并被釋放到胞外，引起爆發(fā)式炎癥，加重海馬組織炎性損傷（圖6a）。提示，CUMS抑郁小鼠海馬組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生可能與 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸的調(diào)控有關(guān)。雖然 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸在抑郁小鼠海馬組織炎癥的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但有氧運(yùn)動能否干預(yù)該信號通路軸的差異表達(dá)尚未確定。

圖6 TLR4/miR-223/NLRP3參與CUMS抑郁小鼠海馬炎癥反應(yīng)Figure 6. The Mechanism of TLR4/miR-223/NLRP3 Involved in Hippocampus Inflammatory Response in CUMS Depression Mice

3.2 有氧運(yùn)動干預(yù)抑郁小鼠海馬 TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸進(jìn)而拮抗炎癥反應(yīng)

有氧運(yùn)動拮抗炎癥反應(yīng)已被證實(shí)，但有氧運(yùn)動拮抗抑郁小鼠海馬組織炎癥的細(xì)胞分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在很大程度上仍是未知的。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/miR-223/NLRP3信號通路可能參與了有氧運(yùn)動拮抗抑郁小鼠海馬組織炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸過程。在抑郁小鼠海馬組織炎癥反應(yīng)中，TLR4可激活NF-κB信號通路（劉雯 等,2016），產(chǎn)生不成熟的IL-1β和 IL-18，使 NLRP3得以活化（Kayagaki et al.,2013）；而有氧運(yùn)動可以通過降低 TLR4的激活，誘導(dǎo)炎性因子NF-κB、IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平的低表達(dá)，調(diào)控 miR-223的作用，miRNA-233在通過靶向識別IKKα調(diào)控TLR/NF-κB信號通路的同時(shí)，又負(fù)調(diào)控靶基因 NLRP3，抑制下游炎性因子影響抑郁炎癥（Neudecker et al.,2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3、TLR4、IL-1β與NF-κB等促炎因子在CUMS抑郁小鼠海馬組織中顯著上調(diào)，有氧運(yùn)動能有效降低炎性因子的表達(dá)，使炎癥反應(yīng)減弱（圖 6b）。TLR4被抑制后，促炎因子的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，miR-223的活性增強(qiáng)，并降低炎性因子的差異表達(dá)，減輕抑郁小鼠海馬神經(jīng)炎癥，有氧運(yùn)動干預(yù)能夠使這一效應(yīng)增強(qiáng)。

為驗(yàn)證 miR-223與 TLR4、NLRP3之間的關(guān)系，本研究又對各組小鼠海馬組織進(jìn)行 mRNA和 miRNA的高通量測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。從分析結(jié)果來看，miR-223與 TLR4等誘導(dǎo)的炎性信號通路之間存在較為密切的調(diào)控機(jī)制，主要表現(xiàn)在TLR4激活后可通過NF-κB等轉(zhuǎn)錄子對 miR-223的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，即通過抑制 miR-223結(jié)合并活化 STAT3基因介導(dǎo)抑郁小鼠海馬組織促炎因子的產(chǎn)生，miR-223可同時(shí)通過負(fù)調(diào)控靶基因NLRP3與靶向識別IKKα調(diào)控TLR/NF-κB信號通路，使NLRP3在這一過程中表達(dá)逐漸增高。miR-223的低表達(dá)會增強(qiáng)促炎因子 IL-1β、NF-κB的活性，形成一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)，調(diào)控 TLR4觸發(fā)的海馬組織產(chǎn)生 IL-1β。NLRP3是 miR-223的靶基因，miR-223在單核細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸降低，而NLRP3的表達(dá)逐漸增高，相反，miR-223的高表達(dá)會致使 NLRP3蛋白減少并抑制炎性體產(chǎn)生IL-1β（魏永寶 等,2016）。在這一作用機(jī)制中，TLR4的轉(zhuǎn)錄是其誘導(dǎo)該通路軸的前導(dǎo)因子，由于 TLR4的低表達(dá)或被抑制，使miR-223的表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而抑制NLRP3的蛋白減少，降低炎性體產(chǎn)生促炎因子，這可能是 TLR4/miR-223/NLRP3軸在發(fā)揮作用。在此過程中，TLR4所扮演的角色是否發(fā)揮了激活miR-223的過程，以及TLR4被抑制是否影響到miR-223的差異表達(dá)。為此，該實(shí)驗(yàn)針對 CUMS抑郁小鼠實(shí)施了TAK-242的腹腔注射，來抑制TLR4的表達(dá)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，白介素1受體相關(guān)激酶（Interleukin-1 receptorassociated kinase 1，IRAK1）的磷酸化也可通過負(fù)調(diào)控NF-κB的活性抑制 NLRP3的表達(dá)，同時(shí)，IRAK1在快速炎癥小體反應(yīng)過程中可繞過NLRP3的翻譯及翻譯后修飾等的過程，直接作為TLR4與NLRP3間的橋梁啟動炎癥反應(yīng)（Lin et al.,2014），這一反應(yīng)過程也與TLR4的激活影響miR-223靶向識別IKKα的調(diào)控作用有關(guān)（圖7）。

圖7 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS抑郁小鼠海馬組織TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸的KEGGFigure 7. The KEGG Analysis Map of TLR4/miR-223/NLRP3 Signaling Pathway Axis in Hippocampus of CUMS Depression Mice after Aerobic Training

3.3 TLR4抑制聯(lián)合有氧運(yùn)動干預(yù)TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸進(jìn)而拮抗海馬炎癥效果

本研究采用TLR4抑制劑TAK-242對CUMS抑郁小鼠進(jìn)行刺激，RT-PCR檢測各組小鼠海馬組織的 miR-223及相關(guān)炎性因子 mRNA的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，TLR4被抑制后 miR-223在海馬組織內(nèi)的表達(dá)顯著上調(diào)，且有氧運(yùn)動有助于 miR-223的進(jìn)一步表達(dá)，并有效抑制促炎細(xì)胞因子的高表達(dá)和增強(qiáng)抑炎因子的表達(dá)，起到良好的抗炎效果。這可能與 TAK-242通過抑制 TLR4的基因表達(dá)，激活miR-223活性增加，增強(qiáng)其靶向識別IKKα調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路的作用（Wang et al.,2015），降低其下游的炎性因子的IL-1β、NLRP3等的表達(dá)。ME組與TE組小鼠對比結(jié)果顯示，TLR4抑制后再進(jìn)行有氧運(yùn)動有助于降低炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子的釋放，其效果優(yōu)于單純有氧運(yùn)動的效果，同時(shí)，TLR4被抑制后，有氧運(yùn)動依然能夠增加IL-10的信號表達(dá)量，但相比于MG組與TG組而言，不呈顯著性差異。令人詫異的是，與 MG組小鼠相比，ME組海馬組織的炎性因子和抑炎因子的mRNA差異表達(dá)與TG組相關(guān)因子的差異表達(dá)趨勢高度一致。由此推斷，有氧運(yùn)動干預(yù)能夠降低 TLR4的因子表達(dá)，并進(jìn)一步拮抗CUMS抑郁小鼠海馬組織的炎性損傷。在 TG組小鼠中，miR-223的基因表達(dá)水平升高，較 MG組相比呈現(xiàn)顯著性差異，說明 TLR4被抑制后確實(shí)能夠增強(qiáng) miR-223的表達(dá)。此外，針對TLR4被抑制后再實(shí)施有氧運(yùn)動康復(fù)，其miR-223的值可持續(xù)增高，但與抑制劑組相比其結(jié)果不呈顯著性差異，相比模型組呈顯著性差異。提示，TLR4抑制劑能在一定程度上減輕抑郁小鼠的炎性反應(yīng)，但抑制劑與有氧運(yùn)動的聯(lián)合干預(yù)能夠有效降低抑郁小鼠海馬組織的炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動能顯著增加 CUMS抑郁小鼠海馬組織 miR-223和抑炎因子 IL-10的表達(dá)，降低 TLR4、IL-1β、NF-κB、NLRP3等的表達(dá)水平，且海馬組織 miR-223表達(dá)水平與 TLR4呈顯著性負(fù)相關(guān)。推測有氧運(yùn)動能夠通過抑制 TLR4的表達(dá)，調(diào)節(jié) miR-223靶向識別 IKKα的能力，調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路，阻礙其下游靶基因NLRP3的活性，降低 IL-1β等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平。表明，有氧運(yùn)動改善抑郁小鼠海馬組織功能，發(fā)揮抗炎作用，可能與TLR4/miR-223/NLRP3信號通路軸的激活有關(guān)。

4 結(jié)論

有氧運(yùn)動可顯著降低 CUMS抑郁小鼠海馬組織 TLR4的表達(dá)，誘導(dǎo)炎性因子IL-1β及NF-kB轉(zhuǎn)錄子的低表達(dá)，調(diào)控miR-223的高表達(dá)，激活TLR4/imRNA-223/NLRP3通路，靶向抑制NLRP3蛋白活性，抑制炎性因子的釋放，減弱抑郁小鼠海馬組織炎癥，調(diào)控其抗炎效果。

有氧運(yùn)動改善抑郁小鼠海馬功能與提高抑郁小鼠海馬組織miR-223的表達(dá)，激活TLR4/imRNA-223/NLRP3通路軸關(guān)系密切。

因此，有氧運(yùn)動及其運(yùn)動替代物有可能通過干預(yù)miRNAs的表達(dá)發(fā)揮對抑郁癥海馬組織的保護(hù)效應(yīng)，可為抑郁癥及腦神經(jīng)疾病患者運(yùn)動康復(fù)手段的篩選及干預(yù)提供新思路。

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