金匱腎氣湯促進(jìn)糖尿病小鼠腎臟足細(xì)胞自噬

劉春燕，楊勝輝，朱 偉，曾 輝，唐 群

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)1. 病理學(xué)教研室、2. 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室、3. 生理學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。研究表明，糖尿病發(fā)病10～20年后，大約20%患者會(huì)發(fā)展為DN，最終進(jìn)展為終末期腎病[1]。目前，我國(guó)DN已成為終末期腎功能衰竭的第2位病因，造成沉重的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。

DN發(fā)生的標(biāo)志性事件是腎小球微血管通透性增高，形成微量蛋白尿。而足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿持續(xù)發(fā)生和DN進(jìn)展的重要原因。目前研究證實(shí)，對(duì)于足細(xì)胞等終末分化細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育而言，自噬具有重要意義。足細(xì)胞在生理狀態(tài)下就具有較高的自噬水平，自噬通過(guò)降解清除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，來(lái)維持足細(xì)胞功能[3]。在自然衰老及腎小球受損時(shí)，足細(xì)胞的自噬功能受到抑制，自噬抑制劑或敲除自噬相關(guān)基因的足細(xì)胞，其濾過(guò)功能明顯降低[4]，提示足細(xì)胞自噬在維持腎小球功能中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK-mTOR途徑是與營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)的自噬調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路。

DN進(jìn)展到腎功能衰竭的過(guò)程屬陽(yáng)氣衰敗，水濕瘀濁內(nèi)聚。因此，當(dāng)以溫補(bǔ)腎陽(yáng)、化氣行水大法。金匱腎氣湯是溫補(bǔ)腎陽(yáng)、化氣行水的代表方。金匱腎氣湯廣泛應(yīng)用于泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病治療。金匱腎氣湯能夠調(diào)節(jié)Bcl-2/Fas基因表達(dá)，抑制腎小球細(xì)胞凋亡[5]，還能降低 II 型糖尿病腎病血糖、尿白蛋白排泄率，從而促進(jìn)腎組織損傷修復(fù)、保護(hù)腎臟功能[6]。本研究旨在通過(guò)db/db糖尿病小鼠模型，觀察金匱腎氣湯對(duì)足細(xì)胞自噬和AMPK-mTOR信號(hào)通路的影響，探討金匱腎氣湯改善DN進(jìn)展的分子機(jī)制，為臨床防治DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型的建立4周齡♂ SPF級(jí)C57BL/KsJ-db/db小鼠20只，作為II型糖尿病動(dòng)物模型；4周齡♂ C57BL/KsJ-db/m小鼠5只，作為正常對(duì)照組(control)。小鼠均購(gòu)自上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2014-0012。6周齡時(shí)，將20只db/db小鼠隨機(jī)分為4組(每組5只)，并開(kāi)始灌胃，分別為：生理鹽水組(db/db)、金匱腎氣湯低劑量組(db/db+JG1, 1.3 g·kg-1)、金匱腎氣湯高劑量組(db/db+JG2, 2.6 g·kg-1)、二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組(db/db+MF, 0.2 g·kg-1)。于第18周齡處死動(dòng)物。

1.2藥物制備金匱腎氣湯各配方顆粒，購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司。成人每日量10 g，包括茯苓顆粒1 g(相當(dāng)于飲片量為10 g，以下括號(hào)內(nèi)數(shù)值同)、牡丹皮顆粒1 g(6 g)、熟地黃4 g(10 g)、山藥0.5 g(10 g)、澤瀉1 g(10 g)、酒萸肉1.5 g(6 g)、桂枝0.5 g(6 g)、附片0.5 g(3 g)。將每10 g顆粒充分溶解于加熱后的蒸餾水中。藥物根據(jù)動(dòng)物/人體表面積法折算，結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，金匱腎氣湯低、高劑量組劑量分別為1.3、2.6 g·kg-1。鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品，溶解于蒸餾水中，劑量為0.2 g·kg-1。

1.3血糖、腎功能檢測(cè)18周時(shí)，尾靜脈取血，用血糖儀檢測(cè)血糖(三諾GA-3血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司)；眼眶取血，分別用尿素氮測(cè)定試劑盒、肌酐測(cè)定試劑盒(寧波醫(yī)杰生物科技有限公司)，檢測(cè)血清尿素氮和肌酐水平；留24 h尿液，分別用白蛋白測(cè)定試劑盒和肌酐測(cè)定試劑盒(寧波醫(yī)杰生物科技有限公司)，測(cè)定24 h尿白蛋白排泄量和尿肌酐。

1.4腎組織病理學(xué)檢查18周齡處死動(dòng)物后，留取雙側(cè)腎皮質(zhì)，一部分腎皮質(zhì)用4%多聚甲醛固定后，制作成3 μm厚石蠟切片，進(jìn)行過(guò)碘酸希夫反應(yīng)(PAS)染色，用奧林巴斯BX-50顯微鏡觀察腎小球內(nèi)系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)增生情況。一部分腎皮質(zhì)用2.5%戊二醛固定后，制作成50～100 nm切片，用3%醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡(日立H7700)觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)。

1.5免疫組織化學(xué)染色采用SP法，按照試劑盒的操作步驟，檢測(cè)足細(xì)胞Wilms腫瘤特異性基因(Wilms′ tumor protein 1, WT1)在腎小球的表達(dá)。兔抗小鼠WT1抗體(德國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab89901)。光鏡下胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，400倍下隨機(jī)采集20個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算平均值。

1.6Westernblot檢測(cè)采用2×SDS裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。牛奶室溫封閉1 h后，分別加入LC3Ⅱ/Ⅰ(貨號(hào)12741S)、p62(貨號(hào)5114S)、p-mTOR(貨號(hào)5536S)、mTOR(貨號(hào)2972S)、p-AMPK(貨號(hào)2535S)、AMPK(貨號(hào)5832S)一抗(抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加入二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，用ECL顯色并曝光，采用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度掃描。

2 結(jié)果

2.1金匱腎氣湯對(duì)生化指標(biāo)的影響為探討金匱腎氣湯對(duì)db/db小鼠的腎保護(hù)作用，測(cè)定血糖、尿白蛋白、尿肌酐和血清肌酐水平。Tab 1結(jié)果顯示，db/db小鼠血糖、血肌酐、24 h尿白蛋白、尿白蛋白/肌酐水平均明顯高于db/m小鼠(P<0.01)，提示db/db糖尿病小鼠腎功能受損。治療12周后，二甲雙胍可使db/db小鼠血糖、血肌酐、24 h尿白蛋白、尿白蛋白/肌酐水平明顯降低(P<0.05)；金匱腎氣湯高劑量組可明顯降低db/db小鼠血肌酐、24 h尿白蛋白、尿白蛋白/肌酐水平(P<0.05)；金匱腎氣湯低劑量組可明顯降低db/db小鼠24 h尿白蛋白、尿白蛋白/肌酐水平(P<0.05)。提示金匱腎氣湯可減輕db/db小鼠腎臟損傷，改善腎功能，但對(duì)血糖影響不明顯。

2.2金匱腎氣湯改善db/db小鼠腎小球病變采用PAS染色觀察db/db小鼠腎小球的病理變化。如Fig 1所示，與正常對(duì)照組相比，db/db小鼠腎小球系膜區(qū)明顯增寬，金匱腎氣湯低、高劑量組及二甲雙胍組小鼠腎小球內(nèi)系膜區(qū)增寬程度較生理鹽水組減輕，且金匱腎氣湯高劑量組腎小球系膜區(qū)增寬程度較二甲雙胍組輕，表明金匱腎氣湯延緩了DN腎小球病變的進(jìn)展。

2.3金匱腎氣湯對(duì)db/db小鼠腎小球足細(xì)胞損傷的影響采用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記腎小球足細(xì)胞WT1的表達(dá)。如Fig 2所示，與正常對(duì)照組相比，db/db糖尿病小鼠生理鹽水組腎小球內(nèi)WT1陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)量明顯減少；金匱腎氣湯治療后，低劑量組WT1陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量有所增加，金匱腎氣湯高劑量組和二甲雙胍組陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量明顯增加(P<0.05)。提示金匱腎氣湯可減輕db/db小鼠腎臟足細(xì)胞損傷。

Tab 1 Comparison of biochemical indicators in different groups of

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsdb/db

Fig1Pathologicalchangesofkidneyineachgroupofmice(PAS, ×400)

A:Control;B:db/db;C:db/db+JG1;D:db/db+JG2;E:db/db+MF.Red arrow showed mesangial region in glomerulus.

Fig2NumberofWT1positivecellsindifferentgroups(×400)

A:Control;B:db/db;C:db/db+JG1;D:db/db+JG2;E:db/db+MF.F:Number fo WT1 possitive cells.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsdb/db

2.4金匱腎氣湯對(duì)db/db小鼠腎小球足細(xì)胞自噬的影響為了闡明自噬在金匱腎氣湯腎臟保護(hù)中的作用，采用透射電子顯微鏡檢測(cè)腎小球足細(xì)胞內(nèi)自噬體的情況。Fig 3結(jié)果顯示，正常組小鼠腎小球足細(xì)胞內(nèi)可看到自噬體，db/db小鼠足細(xì)胞內(nèi)自噬體缺失，而金匱腎氣湯高劑量組和二甲雙胍組小鼠腎小球足細(xì)胞內(nèi)也可見(jiàn)自噬體。采用Western blot檢測(cè)腎組織中LC3和p62的蛋白表達(dá)，如Fig 4所示，生理鹽水組db/db小鼠腎皮質(zhì)LC3Ⅱ表達(dá)降低，p62表達(dá)增高；金匱腎氣湯高劑量組和二甲雙胍組小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)LC3Ⅱ表達(dá)明顯增強(qiáng)，p62表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明，金匱腎氣湯的腎臟保護(hù)作用可能與改善糖尿病小鼠腎臟足細(xì)胞自噬不足有關(guān)。

Fig3Transmissionelectronmicroscopyofkidneysindifferentgroups(×2 000)

A:Control;B:db/db;C:db/db+JG1;D:db/db+JG2;E:db/db+MF.Red arrow showed autophagosome in podocytes.

2.5金匱腎氣湯通過(guò)AMPK-mTOR通路調(diào)節(jié)db/db小鼠腎小球足細(xì)胞自噬AMPK的激活和mTOR信號(hào)的衰減可促進(jìn)自噬。如Fig 5所示，與db/db糖尿病小鼠相比，金匱腎氣湯明顯增強(qiáng)AMPK磷酸化，抑制mTOR磷酸化(P<0.05)。提示金匱腎氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)足細(xì)胞自噬，從而保護(hù)足細(xì)胞。

3 討論

金匱腎氣湯方中重用地黃，善滋補(bǔ)腎陰、益精填髓，為君藥。臣以山茱萸、山藥，補(bǔ)肝脾而益精血，加以附子、肉桂之辛熱，助命門以溫陽(yáng)化氣。君臣相伍，補(bǔ)腎填精，溫腎助陽(yáng)，乃陰中求陽(yáng)之治。佐以澤瀉、茯苓利水滲濕泄?jié)?，丹皮清泄肝火，三藥于補(bǔ)中寓瀉。諸藥合用，助陽(yáng)之弱以化水，滋陰之虛以生氣，使腎陽(yáng)振奮，氣化復(fù)常，則諸癥自除。

Fig 4 Expression of LC3I/II and p62 proteins in kidney tissues of each

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsdb/db

前期研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣湯可以減輕db/db糖尿病小鼠腎小球硬化，減少24 h尿蛋白，并激活足細(xì)胞自噬，但具體的分子機(jī)制尚不清楚。本研究首先探討金匱腎氣湯對(duì)db/db糖尿病小鼠腎臟足細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，用金匱腎氣湯治療db/db小鼠12周后，24 h尿白蛋白、血清肌酐和尿白蛋白/肌酐水平降低，系膜基質(zhì)擴(kuò)張減輕，表明金匱腎氣湯可以減緩DN的進(jìn)展。但是，本實(shí)驗(yàn)中金匱腎氣湯并沒(méi)有明顯降低db/db小鼠的血糖水平，這一發(fā)現(xiàn)與金匱腎氣丸臨床治療2型DN患者[7]和干預(yù)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠后[8]，空腹血糖降低的結(jié)果不一致，可能與動(dòng)物和人體的差異或不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀嘘P(guān)。提示金匱腎氣湯對(duì)db/db小鼠的腎保護(hù)作用可能與血糖控制無(wú)關(guān)。金匱腎氣湯與二甲雙胍皆可改善DN，若能同時(shí)用藥可能效果更佳，有待進(jìn)一步探討。糖尿病足細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為足突消失、融合、肥大、脫離和死亡等[9]。蛋白尿的產(chǎn)生與足細(xì)胞密度降低和足細(xì)胞形態(tài)改變有關(guān)[10-11]，足細(xì)胞數(shù)量的減少可以預(yù)測(cè)蛋白尿的程度和腎功能的逐漸下降。WT1是腎臟發(fā)生過(guò)程中的一種重要蛋白，對(duì)維持腎臟成熟足細(xì)胞的表型及功能狀態(tài)起重要作用。本研究觀察到，與正常對(duì)照組相比，db/db糖尿病小鼠生理鹽水組腎小球內(nèi)WT1陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)量明顯減少；金匱腎氣湯治療后，低劑量組WT1陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量有所增加，金匱腎氣湯高劑量組和二甲雙胍組陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量明顯增加。結(jié)果提示金匱腎氣湯可減輕db/db小鼠腎臟足細(xì)胞損傷，從而改善腎功能和蛋白尿。

Fig 5 Expression of p-mTOR/mTOR and p-AMPK/AMPK proteins in kidney tissues of each

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsdb/db

足細(xì)胞具有活躍的自噬能力，即使在非應(yīng)激狀態(tài)下也是如此，這表明足細(xì)胞需要較高的基礎(chǔ)自噬水平來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Lenoir等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在特異性敲除足細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5后，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，足細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)泛素化蛋白聚集、線粒體損傷、自噬活性減弱，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化，表明自噬對(duì)維持足細(xì)胞的正常功能具有非常重要的作用。Ilatovskaya等[13]研究表明，DN患者出現(xiàn)明顯的足細(xì)胞損傷，如足細(xì)胞足突消失及足細(xì)胞數(shù)量減少，且與蛋白尿產(chǎn)生和腎小球硬化呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣湯恢復(fù)了LC3II的表達(dá)，降低了p62的表達(dá)。此外，電鏡檢查也證實(shí)金匱腎氣湯能增強(qiáng)足細(xì)胞的自噬活性。這些結(jié)果表明，在db/db糖尿病小鼠中，改善足細(xì)胞內(nèi)的自噬不足在金匱腎氣湯的腎保護(hù)作用中起著重要作用。

AMPK-mTOR途徑是與營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)的自噬調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路。Langer等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠降低足細(xì)胞AMPK磷酸化、激活mTOR，從而抑制自噬，二甲雙胍(AMPK激活劑)可以劑量依賴性促進(jìn)自噬、抗凋亡，并且逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與db/db糖尿病小鼠相比，金匱腎氣湯明顯增強(qiáng)AMPK磷酸化，抑制mTOR磷酸化。提示金匱腎氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)足細(xì)胞自噬，從而保護(hù)足細(xì)胞。

綜上所述，金匱腎氣湯通過(guò)AMPK-mTOR途徑促進(jìn)足細(xì)胞自噬，保護(hù)足細(xì)胞，延緩DN的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解金匱腎氣湯在DN中腎保護(hù)作用的分子機(jī)制提供了新的思路。