呂春茂， 李 瀟，孟憲軍，張 璇，孫也婷，李其昌

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

近年來，隨著藥膳兩用功能食品的發(fā)展，中藥指紋圖譜技術(shù)已逐漸拓展到功能食品原料的品質(zhì)評價(jià)及產(chǎn)品加工工藝控制等方面，顯示出良好的應(yīng)用前景[1-2]。色譜指紋圖譜技術(shù)，是國際公認(rèn)的檢測控制物質(zhì)質(zhì)量的最有效手段之一[3]，因此通過建立色譜指紋圖譜同樣可全面反映食用油所含內(nèi)在成分的種類和含量，進(jìn)而反映其質(zhì)量，是當(dāng)前評價(jià)食用油質(zhì)量真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式[4-6]。 楊春英等[7]采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測定了14種植物油中的植物甾醇，并通過聚類分析證明同一品種植物甾醇的一致性；黃宏南等[8]對幾種植物油中生育酚的含量進(jìn)行測定，同時(shí)對其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜進(jìn)行了研究，對植物油鑒定提供了依據(jù)；姚云平等[9]詳細(xì)介紹了植物油中植物甾醇和維生素E的指紋圖譜在植物油品種鑒定和摻假方面的應(yīng)用。

甾醇廣泛存在于自然植物之中，具有降低血液中膽固醇的作用[10-14]，而VE是生物體內(nèi)主要的抗氧化劑之一，兩者都是評價(jià)植物油脂營養(yǎng)功能的重要活性物質(zhì)[15-17]，因此以這兩種活性物質(zhì)作為榛子油特征成分構(gòu)建指紋圖譜將為榛子油樣品的識別和質(zhì)量控制提供有效手段。目前尚未見到有關(guān)榛子油特征成分指紋圖譜研究的相關(guān)報(bào)道，開展榛子油活性物質(zhì)甾醇和VE指紋圖譜研究，不僅可以有效評價(jià)待測榛子油樣品與合格樣品偏離程度，為榛子油的品質(zhì)評價(jià)、質(zhì)量控制及鑒別提供科學(xué)依據(jù)，而且對闡明榛子油活性物質(zhì)的功效具有十分重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇平歐榛子主要栽培區(qū)域的主栽品種作為研究材料，具體包括北部栽培區(qū) （本溪）的遼榛3號、遼榛7號和達(dá)維；中部栽培區(qū)（錦州）的遼榛3號、遼榛7號和達(dá)維；中部栽培區(qū)（山西）的遼榛3號、遼榛7號和達(dá)維；干旱地帶栽培區(qū)（新疆）的遼榛7號和達(dá)維；中部栽培區(qū)（營口）的遼榛3號、遼榛7號和達(dá)維。

試劑：α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑公司產(chǎn)品。

1.2 樣品的制備

1.2.1 正己烷浸提榛子油 將不同地區(qū)不同品種的平歐榛子破殼、剝皮、粉碎，用料液質(zhì)量體積比為1 g∶5 mL的正己烷浸泡榛子粉，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫出溶劑，得金黃透明榛子油。

1.2.2 甾醇樣品預(yù)處理 根據(jù)彭麗霞等[18]的處理方法，稱取榛油9.00 g，至 250 mL三角瓶中，加入60 mL 2.5 mol/L KOH-乙醇溶液，于80℃恒溫水浴上皂化80 min，待皂化完全后取出加入200 mL蒸餾水稀釋。將皂化液轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，用100 mL乙醚和50 mL石油醚混合萃取不皂化物，移出上層萃取液，用80 mL乙醚和40 mL石油醚混合進(jìn)行二次萃取，移出并合并萃取液，用水洗至中性。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除溶劑，用3 mL正己烷（色譜純）溶出剩余物，過0.45 μm有機(jī)濾膜，待測。

1.2.3 VE樣品預(yù)處理 稱取榛油6.00 g，至250 mL三角瓶中，加入60 mL甲醇溶液和10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的抗壞血酸溶液搖勻，再加入20 mL KOH水溶液（質(zhì)量比 1∶2）混勻，于沸水浴上皂化 50～60 min，待皂化完全取出立即冷卻。將皂化液轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，用100 mL蒸餾水分兩次沖洗三角瓶，洗液倒入分液漏斗，再用80 mL乙醚和80 mL石油醚混合萃取皂化液，移出上層萃取液，用50 mL乙醚和50 mL石油醚混合進(jìn)行二次萃取，移出并合并萃取液，用水洗至中性。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除溶劑，用3 mL正己烷（色譜純）溶出剩余物，過0.22 μm有機(jī)濾膜，倒入小瓶待測。

1.3 儀器

7980A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀、1100高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品。

甾醇GC-MS條件：色譜柱為DB-17MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為 He，進(jìn)樣口溫度 250 ℃，初始柱溫180℃，直接以15℃/min升到280℃，保持 22 min，柱流量 1 mL/min，分流比 20∶1，進(jìn)樣量1 μL。離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu，溶劑延遲3 min[7]。

VE HPLC條件：色譜柱為Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相V（甲醇）∶V（水）=98∶2，檢測波長 292 nm，流量為 1.0 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣20 μL[19]。

1.4 平歐榛子VE和甾醇指紋圖譜的建立

以各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積為依據(jù)來進(jìn)行共有峰的標(biāo)定，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”（國家藥典委員會，A版為研究版，主要用于科學(xué)研究工作，具有生成對照圖譜功能）進(jìn)行共有峰的匹配，選取參照譜，匹配共有峰并生成對照圖譜。

1.5 數(shù)據(jù)分析

參照 《中藥注射液指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行 ）》對14種平歐榛子樣品活性物質(zhì)甾醇和VE分別進(jìn)行GC-MS和HPLC分析。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”，生成對照圖譜，進(jìn)行相似度分析。利用“SPSS19.0”軟件進(jìn)行聚類分析，以相對峰面積為依據(jù)做樹狀圖，進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜分析方法評價(jià)

取樣品預(yù)處理后的待測液，按照1.3節(jié)條件連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄甾醇和VE主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，用于考察精密度。按照 1.3節(jié)條件在 0、2、4、6、8 h不同的時(shí)間進(jìn)樣，用于考察穩(wěn)定性。按照1.2.2和1.2.3節(jié)方法，平行制備3組樣品待測液，分別按照1.3節(jié)條件進(jìn)樣，用于考察重復(fù)性。

選取遼榛7號（新疆）進(jìn)行甾醇的分析方法評價(jià)；選取遼榛3號（山西）進(jìn)行VE的分析方法評價(jià)。從表1可以看出，各保留時(shí)間的RSD值均小于2%，峰面積的RSD值均小于5%，根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局頒布的《中藥注射液指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，采用的分析方法符合指紋圖譜的建立要求[20]。

2.2 平歐榛子樣品甾醇和VE組成分析

配制VE標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)條件進(jìn)樣，以確定各單體的出峰時(shí)間。從圖1可以看出，該方法可以較好地將VE的3種單體進(jìn)行分離。醇單體菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、巖藻甾醇、蒲公英甾醇、α1-谷甾醇和VE的單體α-VE和δ-VE，但含量略有差別。

表1 保留時(shí)間和峰面積的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision，stability and reproducibility results of according to the retention time and peak area

圖1 VE標(biāo)準(zhǔn)品單體HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of VE standards

2.3 平歐榛子甾醇GC-MS標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立及分析

2.3.1 平歐榛子甾醇GC-MS標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立如圖3所示，將14種樣品榛子甾醇指紋圖譜同時(shí)導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”軟件，以本溪地區(qū)達(dá)維品種的甾醇色譜圖為參照譜，β-谷甾醇色譜峰為參照峰，匹配共有峰，并生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，14個(gè)樣品色譜圖中匹配并標(biāo)定出6個(gè)共有峰。

2.3.2 平歐榛子甾醇GC-MS指紋圖譜的分析 如表3所示，14種平歐榛子甾醇色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均高于為0.99，根據(jù)《中藥注射液指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，符合指紋圖譜的建立要求[21-22]，可以建立平歐榛子甾醇的共有模式。通過比較不同樣品間的相似度發(fā)現(xiàn)，不同樣品間的相似度均達(dá)0.98以上，整體相似性較高。

圖2 平歐榛子14個(gè)樣品甾醇GC-MS色譜疊加圖和VE的HPIC色譜疊加圖Fig.2 GC-MS and HPLC superimposed of sterol and vitamin E of 14 kinds of Flat-European hybrid hazelnut samples

表2 平歐榛子14個(gè)樣品甾醇和VE單體組成Table 2 Sterol and vitamin E monomer composition in 14 kinds of Flat-European hybrid hazelnut samples

圖3 平歐榛子甾醇的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.3 Standard fingerprint of sterol in Flat-European hybrid hazelnut

如圖4所示，14種平歐榛子樣品中甾醇根據(jù)聚類分析聚為4類：山西遼榛7號、新疆遼榛7號和山西遼榛3號聚為一類；本溪遼榛3號、營口遼榛3號和本溪遼榛7號聚為一類；本溪達(dá)維、營口達(dá)維、山西達(dá)維、新疆達(dá)維和錦州遼榛3號聚為一類；錦州遼榛7號、營口遼榛7號和錦州達(dá)維聚為一類。由此可見，同一品種平歐榛子基本聚為一類，雖然有不同品種混合聚為一類，但在類內(nèi)，同一品種更為接近，根據(jù)品種的不同而聚出類別，說明平歐榛子中的甾醇組成受品種的影響更大。

表3 14種平歐榛子甾醇色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜間的相似度Table 3 Similarities between sterol fingerprints of 14 kinds of Flat-European hybrid hazelnut and standard fingerprint

圖4 平歐榛子14個(gè)樣品中甾醇的聚類樹狀圖Fig.4 Clustering dendrogram of sterol in 14 kinds of Flat-European hybrid hazelnut samples

2.4 平歐榛子VE HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 平歐榛子VE HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立如圖5所示，將14種樣品榛子VE指紋圖譜分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”軟件，以本溪地區(qū)達(dá)維榛子VE圖譜為參照譜，α-VE色譜峰為參照峰，匹配共有峰，并生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖相對比后，匹配并標(biāo)定出2個(gè)共有峰。

2.4.2 平歐榛子VE HPLC指紋圖譜的分析 如表4所示，平歐榛子14個(gè)樣品VE HPLC指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均為0.8左右，也符合指紋圖譜的建立要求。比較不同樣品間的相似度，整體信息較為離散，存在著較大的個(gè)體差異。進(jìn)一步比較同一品種在不同地區(qū)樣品間和同一地區(qū)不同品種樣品間VE色譜圖的相似度后發(fā)現(xiàn)，同一品種各地區(qū)之間相似度具有較大差異，而對于同一地區(qū)各品種樣品，除錦州地區(qū)外，本溪、山西和營口的各個(gè)品種間的相似度均在0.9以上，顯示了較好的相似性，這說明不同品種間的相似性要高于不同地區(qū)間的相似性，平歐榛子VE的相似性更大程度上取決于種植地區(qū)。

圖5 平歐榛子VE的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.5 Standard fingerprint of VE in Flat-European hybrid hazelnut

表4 14種平歐榛子VE色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜間的相似度Table 4 Similarities between VE fingerprints of 14 kinds of Flat-European hybrid hazelnut and standard fingerprint

如圖6所示，14種平歐榛子樣品中VE根據(jù)聚類分析聚為4類：本溪遼榛3號、本溪遼榛7號、本溪達(dá)維、錦州遼榛7號、新疆遼榛7號、營口達(dá)維聚為一類（類1）；錦州遼榛3號自成一類（類2）；營口遼榛3號、營口遼榛7號和錦州達(dá)維聚為一類（類3）；山西遼榛3號、山西遼榛7號、遼榛達(dá)維和新疆達(dá)維聚為一類（類4）。由此可以看出，相同地區(qū)的樣品基本聚為一類，類3和類4尤為明顯，這種根據(jù)地區(qū)的不同而聚出類別，說明種植地區(qū)對平歐榛子中的VE有更大的影響，這與相似度分析的結(jié)果一致。雖然有不同地區(qū)樣品歸為一類，是由于部分種植地區(qū)的地理、氣候條件較為接近，以及品種本身的個(gè)體差異致使樣品中VE的整體較為接近。

3 結(jié) 語

通過測定14種平歐榛子樣品甾醇和VE的組成，進(jìn)行聚類分析的同時(shí)，建立了上述兩種活性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并進(jìn)行了不同樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度分析，14個(gè)樣品中甾醇整體相似度較高，而VE整體相似度較低，存在著個(gè)體差異，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)樣品間VE的相似度同樣較低，而不同品種樣品中VE整體的相似度更為接近，且高于不同地區(qū)間的相似度，說明平歐榛子中活性物質(zhì)VE組成受種植地區(qū)的影響較大；聚類分析結(jié)果表明，14種平歐榛子樣品中甾醇可根據(jù)品種的不同聚類，而VE可根據(jù)地區(qū)的不同聚類，兩種活性物質(zhì)顯示出了不同的聚類依據(jù)，這也反映出同樣一種平歐榛子中活性成分的差異。

總之，采用指紋圖譜相似度評價(jià)與聚類分析相結(jié)合的方式，能更加準(zhǔn)確地確定平歐榛子甾醇及VE等活性物質(zhì)組成的關(guān)系，可為平歐榛子的品種繁育、質(zhì)量評價(jià)與控制提供一定理論依據(jù)。