王雪穎 宗兆運 焦玉佩 許麗娜 王昱淞 栗琳 劉曉蕙

摘?要?基于甲基化反應(yīng)，建立了同時測定磷脂酸和溶血磷脂酸的超高液相色譜-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q Exactive Orbitrap MS）高通量定性與定量分析方法，并用于小鼠衰老模型腦組織樣品的測定。樣品經(jīng)氯仿-甲醇溶劑進(jìn)行全脂提取，使用三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化試劑改善磷脂酸和溶血磷脂酸的色譜峰形，并采用高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴型掃描模式（Full MS/dd-MS2），利用Tracefinder軟件自建本地二級碎片數(shù)據(jù)庫，結(jié)合正離子和負(fù)離子兩種掃描模式下的碎片規(guī)律進(jìn)行高通量的鑒定和定量分析。在本實驗條件下，標(biāo)準(zhǔn)品PA（14∶0/14∶0）的線性相關(guān)指數(shù)大于0.99，定量限為0.125 μg/mL，日內(nèi)和日間精密度小于8.5%。將本方法用于C57BL/6小鼠衰老模型腦組織中，成功鑒定并定量檢測了14個溶血磷脂酸和磷脂酸分子。脂肪酸鏈的數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，含有多不飽和脂肪酸鏈的磷脂酸在衰老過程中呈現(xiàn)下降趨勢。本方法具有較高靈敏度及準(zhǔn)確度，適用于生物體內(nèi)磷脂酸和溶血磷脂酸的定性與定量分析。

關(guān)鍵詞?溶血磷脂酸; 磷脂酸; 甲基化; 高分辨質(zhì)譜; 高通量

1?引 言

磷脂酸（Phosphatidic acid， PA）是生物體內(nèi)最簡單的一類甘油磷脂。其分子以甘油為骨架，甘油3位的羥基被磷酸基團(tuán)取代，1和2位羥基分別被兩個脂?；〈?，形成 PA。雖然PA在生物體內(nèi)含量很少，但其作為生物膜的組成成分、線粒體形態(tài)的影響因子和脂質(zhì)的第二信使等，在生物體內(nèi)具有重要功能[1～4]。PA在磷脂酶A2 （Phospholipase A2， PLA2）的作用下可生成溶血磷脂（Lysophosphatidic acid， LPA）[5]。LPA作為一種細(xì)胞間的磷脂信使，可以激活G蛋白偶聯(lián)受體，進(jìn)而產(chǎn)生多種生物效應(yīng)[6，7]。在臨床方面，LPA在多種重大疾?。ㄈ缧哪X血管病、腫瘤等）的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[8]。

目前，關(guān)于磷脂酸類化合物的分析方法有很多，如薄層色譜法（TLC）[9]、毛細(xì)管電泳法（CE）[10]、氣相色譜法（GC）[11]和質(zhì)譜法（MS）[12]等。TLC可以分析磷脂酸總脂含量，但是不能進(jìn)行分子分析，而CE和GC可以對脂質(zhì)分子進(jìn)行高靈敏分析，但是重現(xiàn)性不佳和復(fù)雜基質(zhì)解析能力低使得該技術(shù)受到一定限制。隨著分析技術(shù)的快速發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其選擇性好、靈敏度高、樣品前處理簡單等優(yōu)勢，成為檢測脂質(zhì)的主流技術(shù)[13～15]。然而，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特性，磷脂酸在液相色譜系統(tǒng)的分離檢測具有一定的挑戰(zhàn)性。Ogiso 等[16]在反相色譜系統(tǒng)中添加磷酸，改善磷脂酸的色譜行為，該方法雖然改善了磷脂酸的分析，但磷酸的使用與質(zhì)譜的兼容性不佳。Cifkova等[17]在親水相互作用色譜系統(tǒng)中建立了包括磷脂酸在內(nèi)的脂質(zhì)檢測方法。但反相色譜系統(tǒng)因其良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性及分子分離能力，仍然被廣泛應(yīng)用于脂類分析。Clark等[18]在檢測多磷酸磷脂酰肌醇時，提出用三甲基硅烷化重氮甲烷試劑（TMS）與磷酸基團(tuán)上的羥基反應(yīng)。該反應(yīng)專一性很強(qiáng)，反應(yīng)效率很高。Lee等[19]也成功地將此反應(yīng)用于心磷脂的相對定量分析。本研究基于反向液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，將甲基化反應(yīng)引入到磷脂酸的檢測中，改善其色譜行為，提高了檢測靈敏度，并結(jié)合本地自建數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)對生物體復(fù)雜樣品中的溶血磷脂酸和磷脂酸的高通量定性與定量分析。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)、Q-Exactive靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）; F6/10超細(xì)勻漿器（上海弗魯克公司）; TDZ4常溫臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀公司）; 氮氣吹干儀（上海喬躍電子有限公司）; ME104電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

磷脂酸標(biāo)準(zhǔn)品1，2-二豆蔻酰-甘油-3-磷酸單鈉鹽（1，2-Ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate sodium salt， PA（14∶0/14∶0））和1，2-雙硬脂?；?-甘油-3-磷酸鈉（1，2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphate sodium salt， PA（18∶0/18∶0））（美國Avanti公司）; 異丙醇、甲醇、乙腈、氯仿、甲基叔丁醚（MTBE）、水和乙酸銨（色譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司）; 三甲基硅烷化重氮甲烷（TMS，2.0 mol/L己烷溶劑）、冰乙酸（分析純，美國Sigma-Aldrich公司）。

2.2?脂質(zhì)的提取和甲基化

2.2.1?脂質(zhì)的提取?取C57BL/6小鼠腦組織約200 mg 于4 mL玻璃管中，按重量比例加入約2 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V），勻漿兩次，勻漿10 s停10 s。按水相與有機(jī)相1∶4（V/V）的比例，加入500 μL水進(jìn)行萃取，渦旋混合30 s，靜置10 min，如此反復(fù)3次，充分抽提后， 以3000 r/min離心15 min，等體積取出下層有機(jī)相，氮吹至干，備用。

2.2.2?甲基化反應(yīng)?于上述備用樣品中加入200 μL復(fù)溶試劑（甲基叔丁醚-甲醇，20∶6，V/V）， 加入25 μL TMS，渦旋混勻，在室溫下反應(yīng) 20 min，加入2.5 μL冰乙酸終止反應(yīng)。加入45 μL水， 混勻，靜置分層， 3000 r/min離心10 min，取上層液于上樣瓶中，備用。

2.3?儀器分析條件

液相色譜條件： Cortecs C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm，美國Waters公司）; 柱溫： 40℃; 流速： 0.22 mL/min; 流動相A 為 60% 乙腈-40% 水（含10 mmol/L 乙酸銨），B 為 90%異丙醇-10% 乙腈。線性梯度洗脫： 0～2.5 min，33% B; ?2.5～25 min，33%～98% B; 25～30 min，98% B; 30～31 min，98%～33% B; 31～35 min，33% B; 進(jìn)樣量 2 μL。

質(zhì)譜條件： 加熱電噴霧離子源（HESI），離子傳輸管溫度 320℃; 輔助氣溫度300℃; 鞘氣： 35 arb; 輔助氣： 10 arb; 掃描模式： 數(shù)據(jù)依賴型掃描模式（Full MS/ dd-MS2），一級質(zhì)譜分辨率為70000 FWHM，二級質(zhì)譜分辨率為17500 FWHM; 正離子檢測模式： 噴霧電壓 3.0 kV，掃描范圍m/z 240～2000; 負(fù)離子檢測模式： 噴霧電壓2.8 kV， 掃描范圍m/z 150～2000。

2.4?定性定量軟件Tracefinder的參數(shù)設(shè)置

基于商業(yè)Tracefinder 3.2軟件系統(tǒng)，根據(jù)溶血磷脂酸和磷脂酸的母離子和特征子離子的精確質(zhì)量數(shù)信息建立本地數(shù)據(jù)庫。一級和二級質(zhì)譜的質(zhì)量精度分別設(shè)置為8 和 15 ppm，通過選擇相同質(zhì)量數(shù)下的最高色譜峰，并以ICIS的積分方式對其進(jìn)行積分，得到色譜峰峰面積。積分參數(shù)設(shè)置如下： 平滑點數(shù)為3，基線寬度為40，面積噪音為5，峰噪音為10。

3?結(jié)果與討論

3.1?甲基化后溶血磷脂酸和磷脂酸的高通量分析的工作流程

3.1.1?溶血磷脂酸和磷脂酸的甲基化反應(yīng)?三甲基硅烷的甲基化反應(yīng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心磷脂、多磷酸磷脂酰肌醇等多種磷脂的質(zhì)譜分析中[19～21]。其反應(yīng)機(jī)理是在磷脂的磷酸基團(tuán)羥基位點進(jìn)行甲基化反應(yīng)，從而改變磷脂的化學(xué)性質(zhì)。以三甲基硅烷化重氮甲烷試劑（TMS）為衍生化試劑，甲基叔丁醚-甲醇 （20∶6， V/V）為反應(yīng)溶劑，在室溫條件下反應(yīng)20 min。此反應(yīng)條件溫和，操作簡單，衍生化反應(yīng)效率穩(wěn)定。

本研究建立了一種包含自建數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的溶血磷脂酸和磷脂酸高通量分析方法，此方法使用了甲基化修飾結(jié)合高分辨質(zhì)譜儀的分析手段，本地數(shù)據(jù)庫的建立可以高效完成磷脂酸的鑒定與定量工作。首先，獲取新鮮的小鼠腦組織，利用經(jīng)典的氯仿-甲醇提取方法[22，23]進(jìn)行脂質(zhì)萃取，并取下層有機(jī)相氮吹至干。樣品甲基化反應(yīng)后先經(jīng)過液相色譜分離，再分別使用質(zhì)譜的正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測分析。得到原始數(shù)據(jù)后， 使用Tracefinder自建二級數(shù)據(jù)庫進(jìn)行溶血磷脂酸和磷脂酸分子鑒定，進(jìn)而得到可靠的定性和定量信息。

3.1.2?甲基化后磷脂酸的色譜與質(zhì)譜行為?在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中，反相色譜被廣泛用于脂質(zhì)組學(xué)的常規(guī)分析中[16，24]。甲基化對于PA的色譜行為有很大的影響。本研究以標(biāo)準(zhǔn)品PA（18∶0/18∶0）為例，考察甲基化反應(yīng)前后的色譜行為，由PA（18∶0/18∶0）的色譜圖，色譜峰形很差，這使其很難在液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)中被分離和鑒定。由甲基化后的PA（18∶0/18∶0）（為Me-PA（18∶0/18∶0））的色譜圖可見，色譜峰形大大改善，響應(yīng)信號也提高數(shù)倍。上述結(jié)果表明，甲基化反應(yīng)可以大大改善溶血磷脂酸和磷脂酸在反相色譜系統(tǒng)中的色譜行為，提高檢測的靈敏度，進(jìn)而增加該類脂質(zhì)定量分析的準(zhǔn)確性。

在高通量脂質(zhì)分析中，脂質(zhì)分子的可靠鑒定需要依賴二級質(zhì)譜的匹配。而甲基化之后，磷脂酸在高分辨質(zhì)譜中也展現(xiàn)出了獨特的碎裂規(guī)律。通過兩個標(biāo)準(zhǔn)品PA（18∶0/18∶0） 和PA（14∶0/14∶0）考察了其二級質(zhì)譜的碎裂規(guī)律。Me-PA（18∶0/18∶0）和Me-PA（14∶0/14∶0） 負(fù)離子[M-H]的二級質(zhì)譜圖。在負(fù)離子模式中，磷脂酸的特征碎片為脂肪酸鏈FA（18∶0）和FA（14∶0）的碎片離子，荷質(zhì)比分別為m/z 283.2639 和m/z 227.2014。Me-PA（18∶0/18∶0） 和 Me-PA（14∶0/14∶0） 正離子[M+NH4]+的二級質(zhì)譜圖。在正離子模式中，特征性碎片為中性丟失磷酸基團(tuán)后剩下的碎片，m/z分別為607.5639和495.4401。由于單模式的分子鑒定會有一定的假陽性干擾，因此本方法使用正負(fù)離子結(jié)合的方式鑒定溶血磷脂酸和磷脂酸，可以進(jìn)一步提高分子鑒定的可靠性。

3.1.3?本地數(shù)據(jù)庫的建立及檢索?本研究建立了甲基化磷脂酸的二級鑒定數(shù)據(jù)庫，并用于高通量的數(shù)據(jù)分析。由于甲基化磷脂酸在正離子和負(fù)離子二級譜圖中都展現(xiàn)了特有的碎裂規(guī)律，因此，利用該碎裂規(guī)律預(yù)測了不同磷脂酸分子的特征性二級碎片。數(shù)據(jù)庫包含了預(yù)測的一級精確荷質(zhì)比及正負(fù)離子的碎片荷質(zhì)比。其一級和二級質(zhì)譜的精確荷質(zhì)比計算方法如表1所示，其中x和y分別為兩條脂肪酸鏈的碳原子數(shù)， m和n為每個?；湹碾p鍵數(shù)，各元素的精確質(zhì)量數(shù)如下： 碳為12.000000; 氫為1.007825; 氧為15.994915; 磷為30.973762; 氮為14.003074; 質(zhì)子為1.007276。

利用自建數(shù)據(jù)庫使用Tracefinder （Thermo Fisher Scientific， CA）進(jìn)行化合物二級鑒定。在數(shù)據(jù)庫檢索中首先進(jìn)行一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)的匹配，其中正離子為[M+NH4]+，負(fù)離子為[M-H]Symbolm@@。一級匹配完成后，再進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片信息的鑒定，其中正離子以中性丟失羥甲基磷酸后剩下的碎片為PA或LPA的特征離子，負(fù)離子以脂?；鶠樘卣魉槠?。正離子的特征性碎片信息增加了復(fù)雜基質(zhì)的定性能力，而相同色譜保留時間下的負(fù)離子特征性碎片又豐富了脂肪酸鏈信息。正負(fù)離子模式兩次進(jìn)樣得到的數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以實現(xiàn)溶血磷脂酸和磷脂酸高通量的定性篩選和準(zhǔn)確定量分析。

3.2?方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

對甲基化磷脂酸的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度及線性范圍進(jìn)行了評估。由于被測的磷脂酸為生物體內(nèi)源物質(zhì)，為降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，本研究采用野生型小鼠腦作為基質(zhì)，以自然界生物體內(nèi)含量極低的PA（14∶0/14∶0）為標(biāo)準(zhǔn)品，分別考察了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、最低定量限、準(zhǔn)確度和精密度。

3.2.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和最低定量限?稱取約1.5 mg的標(biāo)準(zhǔn)品PA（14∶0/14∶0），以氯仿-甲醇（2∶1， V/V）為溶劑，配制成2 mg/mL的母液。取2.2.1節(jié)中腦組織的全脂樣品作為空白基質(zhì)，配制一系列濃度的溶液，根據(jù)2.2.2節(jié)的衍生化條件進(jìn)行甲基化反應(yīng)，然后檢測。以PA（14∶0/14∶0）的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明，在0.125～500 μg/mL范圍內(nèi)，PA（14∶0/14∶0）的線性良好，線性方程為Y=2882250X-455460 （R2=0.9934），反應(yīng)效率穩(wěn)定，適用于磷脂酸的高靈敏度定量分析。權(quán)重因子為1/X。標(biāo)品PA（14∶0/14∶0）在腦基質(zhì)中能被檢測到的最低定量限（Lower limit of quantification， LLOQ）為0.125 μg/mL。

3.2.2?準(zhǔn)確度和精密度?選取2.2.1節(jié)中腦組織的全脂樣品作為空白基質(zhì)稀釋PA（14∶0/14∶0）母液，分別配制成高、中、低3個濃度水平的樣品。按照2.2.2節(jié)方法進(jìn)行甲基化修飾后，進(jìn)行檢測。每個濃度進(jìn)行3個樣本的生物重復(fù)，且連續(xù)進(jìn)樣3天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到3個濃度的測量值，計算日內(nèi)和日間的精密度。3個濃度的測量值與真值的準(zhǔn)確度以相對誤差表示（表2）。結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度與精密度可以滿足日常檢測的要求。

3.3?實際樣本定量分析

采用本方法對16和24周齡的C57BL/6小鼠腦組織進(jìn)行測定。采用數(shù)據(jù)依賴二級質(zhì)譜掃描模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以自建的本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和定量分析，其分析結(jié)果以熱圖形式顯示。在實驗中，兩組小鼠各選5只，分別進(jìn)行磷脂酸和溶血磷脂酸的差異分析。共鑒定及定量分析了10個磷脂酸分子和4個溶血磷脂酸分子。結(jié)果表明，14周小鼠腦組織中磷脂酸含量及分布與24周小鼠顯示出明顯的不同， 其中4個磷脂酸分子與1個溶血磷脂酸在24周小鼠腦組織中的含量顯著低于14周年輕小鼠（p<0.05）， 在顯著降低的4個磷脂酸分子PA（16∶1/20∶4）、PA（22∶6/22∶6）、PA（22∶4/22∶6）和PA（16∶0/20∶4）中，多不飽和脂肪酸FA（20∶4）＼， ?FA（22∶6）和FA（22∶4）為主要組成脂肪酸鏈。因此，可以推測小鼠在衰老過程中腦組織多不飽和脂肪酸的代謝產(chǎn)生了下降趨勢。

4?結(jié) 論

建立了基于液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法，采用三甲基硅烷化重氮甲烷試劑封閉磷脂酸磷酸羥基反應(yīng)技術(shù)，結(jié)合二級質(zhì)譜正負(fù)離子相互驗證的方法，從脂肪酸鏈的信息出發(fā)，對生物體內(nèi)的溶血磷脂酸和磷脂酸進(jìn)行定量分析的新方法。本方法在自建數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上可以對磷脂酸和溶血磷脂酸進(jìn)行高通量鑒定及定量分析， 具有較好的靈敏度、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度。檢測了16和24周齡的C57BL/6小鼠衰老模型中的腦組織，成功鑒定并定量分析了14種磷脂酸和溶血磷脂酸分子。在24周小鼠的腦組織中，含有多不飽和脂肪酸鏈的多個磷脂酸分子含量明顯低于14周小鼠，預(yù)示多不飽和脂肪酸的代謝在衰老過程中呈下降趨勢。

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