徐 志，王 勝，張重梅，張 英，姬紅麗，倪健英，周益林，彭云良

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610066; 2.四川省農(nóng)業(yè)廳植物保護(hù)站,四川成都 610041; 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193; 4.四川省甘孜藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,四川康定 626000)

小麥白粉病是由禾谷布氏白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf. sp.tritici)引起的一種氣傳病害，在全世界各主要麥區(qū)廣泛分布和危害[1]。自20世紀(jì)70年代末以來(lái)，該病害在中國(guó)的發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，危害程度不斷加重，已成為小麥生產(chǎn)上的最重要病害之一[2]。四川省位于中國(guó)大陸西南腹地，東部為川東平行嶺谷和川中丘陵，中部為成都平原，西部為川西高原，小麥生長(zhǎng)環(huán)境差異大，種植結(jié)構(gòu)多樣化。小麥白粉病菌既能在川西北盆緣地區(qū)越夏，又能在成都平原越冬[3-5]。病菌無(wú)性和有性世代交替繁殖，在長(zhǎng)期的進(jìn)化與選擇中，形成了其獨(dú)特的群體結(jié)構(gòu)[6]。選育和利用抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。但由于新毒性基因的產(chǎn)生及優(yōu)勢(shì)小種的變化，品種抗病性極易喪失。及時(shí)監(jiān)測(cè)該地區(qū)病菌群體毒性的演化，探索群體遺傳變異，對(duì)于制定更為有效的病害控制方法具有重要的意義。本研究利用26個(gè)單基因鑒別品種(系)，對(duì)來(lái)自四川盆地不同地區(qū)189個(gè)菌株進(jìn)行苗期毒性測(cè)定和分析，以期為四川省小麥抗白粉病育種和品種布局提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 小麥白粉病菌菌株

2014-2016年在四川盆地小麥產(chǎn)區(qū)采集小麥白粉病菌閉囊殼標(biāo)樣，采用司權(quán)民[7]的方法進(jìn)行閉囊殼釋放和單孢子堆分離純化，獲得試驗(yàn)菌株189個(gè)，其中位于盆地西部郫縣、新都、廣漢和綿陽(yáng)游仙、鹽亭、安縣、江油分離的菌株數(shù)分別為54、44、19個(gè)和6、36、10、5個(gè)，位于盆地東部敘永、內(nèi)江市中區(qū)、閬中、蒼溪和巴中分離的菌株數(shù)分別為2、2、6、1和4個(gè)。

1.1.2 小麥白粉病菌鑒別寄主

小麥白粉病菌繁殖品種Chancellor、26個(gè)單基因鑒別寄主品種(系)(表1)，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

將純化后的試驗(yàn)菌株分別接種到健康的Chancellor一葉一心盆栽幼苗上，玻璃罩隔離培養(yǎng)，頂端5層紗布封口以防止雜菌污染；18 ℃的恒溫室中，16 h光照培養(yǎng)，繁殖菌種。5～7 d后，將26個(gè)單基因鑒別品種(系)，播種于30 cm×20 cm×5 cm的搪瓷方盤內(nèi)，以感病小麥品種Chancellor作為對(duì)照，套上透明塑料袋，在18 ℃恒溫室中隔離培養(yǎng)。當(dāng)?shù)谝蝗~片完全展開后，采用抖接法接種繁好的白粉菌分生孢子,每個(gè)菌株接種一套鑒別寄主[7]。待對(duì)照品種Chancellor完全發(fā)病后，參照盛寶欽[8]0～4級(jí)法，記載第一葉片的反應(yīng)型。其中，1～2型為抗病反應(yīng)，菌株表現(xiàn)為無(wú)毒性；3～4型為感病反應(yīng)，菌株表現(xiàn)為有毒性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

依據(jù)各菌株對(duì)各鑒別寄主的毒性譜，確定其毒性類型[9]。其中，特有毒性類型是指檢測(cè)頻率僅為1次的毒性類型，共有毒性類型是指兩個(gè)及其以上菌株含有的相同毒性類型。

根據(jù)毒性測(cè)定結(jié)果，將無(wú)毒性的菌株(0～2型)記為“0”，有毒性的菌株(3～4型)記為“1”，構(gòu)建“0-1”毒性矩陣，計(jì)算毒性基因頻率，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)菌株所含有的毒性基因數(shù)(即毒性復(fù)雜度)。毒力頻率=有毒力的菌株數(shù)/供試菌株總數(shù)×100%。

基于“0-1”毒性矩陣，以Popgene1.32軟件[10]在假定哈丁·溫伯格平衡條件下，分別計(jì)算不同病菌群體多樣性參數(shù)：觀察等位基因數(shù)Na(observed number of alleles)、有效等位基因數(shù)Ne(effective number of alleles)、基因多樣性指數(shù)H(Nei’s gene diversity)、信息指數(shù)I(Shannon’s information index)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)NP(the number of polymorphic loci)和多態(tài)位點(diǎn)百分率P(the percentage of polymorphic loci)。根據(jù)Nei’s遺傳距離，構(gòu)建UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)毒性聚類圖。整個(gè)數(shù)據(jù)分析過(guò)程，連鎖不平衡LD測(cè)驗(yàn)(linkage disequilibrium)顯著性水平P值為0.05，中性檢驗(yàn)采用1 000次隨機(jī)抽樣。

表1 四川盆地小麥白粉病菌毒力頻率Table 1 Virulence frequencies of Blumeria graminis f. sp. tritici in Sichuan Basin

2 結(jié)果與分析

2.1 四川盆地小麥白粉病菌毒性類型

189個(gè)菌株對(duì)26個(gè)抗病單基因鑒別品種(系)中的6～21個(gè)具有毒性，平均14.04個(gè)。其中，盆地西部病菌群體對(duì)6～21個(gè)單基因品種(系)具有毒性，平均為13.97個(gè)；盆地東部病菌群體對(duì)9～19個(gè)單基因品種(系)具有毒性，平均為14.93個(gè)(表2)。189個(gè)菌株總計(jì)檢測(cè)出183種毒性類型，其中盆地西部171種，盆地東部15種。僅出現(xiàn)1次的毒性類型有178種，占97.27%，盆地西部和盆地東部病菌群體各自占98.25%和80.00%。

盆地西部和東部病菌群體共有毒性類型有3組(表3)，分別是毒性類型V1a、2、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、6、7、8、13、17、19、30，盆地西部檢測(cè)出2次(鹽亭，2014年；鹽亭，2015年)，東部1次(巴中，2015年)；毒性類型V1a、2、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、6、7、8、17、19、30，盆地西部1次(安縣，2015)，東部1次(巴中，2015年)；毒性類型V1a、2、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、5b、6、7、8、19、30、Era、XBD，盆地西部1次(郫縣，2014年)，東部1次(蒼溪，2014年)。此外，盆地西部檢測(cè)到另外2組共有毒性類型，各出現(xiàn)2次，分別是毒性類型V1a、2、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、5b、6、7、8、19、30、Era(鹽亭，2014；郫縣，2015年)和V1a、3a、3b、3c、3e、3f、4a、5a、6、7、8、17、19、30(鹽亭，2014；郫縣，2016年)。

表2 四川省盆地小麥白粉病菌毒性類型Table 2 Virulence types of Blumeria graminis f. sp. tritici

表3 四川盆地小麥白粉病菌毒性類型及其分布Table 3 Virulence types and distribution of Blumeria graminis f. sp. tritici in Sichuan Basin

毒性類型：僅列出含有≥2個(gè)以上菌株的類型，括號(hào)內(nèi)容為采集地點(diǎn)及年份。

Virulence types:Containing more than one isolate,and the origin is presented in the brackets.

2.2 四川盆地小麥白粉病菌毒力頻率

189份小麥白粉病菌株在26個(gè)單基因鑒別品種(系)上的毒力測(cè)定結(jié)果顯示，供試菌株群體對(duì)抗病基因Pm1a、Pm2、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm19、Pm30的毒力頻率高于60%，對(duì)Pm1c、Pm12、Pm16、Pm21和Pm24的毒力頻率低于20%(表1)。其中，對(duì)Pm21的毒力頻率為0，即未檢測(cè)到對(duì)其表現(xiàn)出有毒性的菌株。

個(gè)別基因在東西部間的分布差異較大(表1)。其中，供試菌株群體對(duì)Pm3d的毒力頻率，在盆地西部和盆地東部分別為47.13%和93.33%；對(duì)Pm13的毒力頻率，分別為17.24%和40%，盆地西部<盆地東部；而對(duì)Pm1c、Pm12、Pm16和Pm24的毒力頻率則相反，盆地西部>盆地東部。

2.3 四川盆地小麥白粉病菌毒性多樣性

小麥白粉病菌群體毒性多樣性結(jié)果顯示，189份樣品的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、信息指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率分別是1.961 5、1.506 3、0.301 4、0.460 1、25和96.15%，說(shuō)明四川盆地小麥白粉病菌其毒性多樣性比較豐富(表4)。

地區(qū)間病菌群體存在一定的差異，盆地西部和盆地東部白粉菌群體的基因多樣性指數(shù)分別為0.300 5和0.273 5，信息指數(shù)分別為0.459 2和0.408 2，多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為96.15%和76.92%。盆地西部病菌群體毒性多態(tài)性整體上高于盆地東部。

189個(gè)菌株毒性聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Nei’s遺傳距離為25.0時(shí)，供試菌株被分為三大類群，來(lái)自盆地東部的2個(gè)菌株聚為第一個(gè)大類群，來(lái)自盆地西部的5個(gè)菌株聚為第二個(gè)大類群，此兩類群均為低毒菌株，其毒性譜變化范圍為6～11，其余182個(gè)菌株聚為第三個(gè)大類群。在Nei’s遺傳距離取值24時(shí)，第三個(gè)大類群可分為兩個(gè)亞類群。第一個(gè)亞類群包含13個(gè)菌株，低毒，其毒性譜范圍為6～13，其中1個(gè)來(lái)自于盆地東部，12個(gè)來(lái)自于盆地西部。剩余169菌株為第二個(gè)亞類群，包含盆地西部菌株157個(gè)和盆地東部菌株12個(gè)(圖1)。

表4 四川盆地小麥白粉病菌群體毒性多樣性指數(shù)Table 4 Virulence diversity parameters of Blumeria graminis f. sp. tritici in Sichuan basin

Na:觀察等位基因數(shù)；Ne:有效等位基因數(shù)；H:基因多樣性指數(shù)；I:信息指數(shù)；NP:多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)；P:多態(tài)位點(diǎn)百分率。

Na:Observed number of alleles;Ne:Effective number of alleles;H:Nei’s gene diversity;I:Shannon’s information index;NP:The number of polymorphic loci;P:The percentage of polymorphic loci.

▲:盆地東部菌株，其他為盆地西部菌株

▲:East Sichuan Basin isolates,the others were derived from West Sichuan Basin

圖1四川189株小麥白粉病菌毒性聚類圖

Fig.1Virulencedendrogramof189wheatpowderymildewisolatesinSichuan

3 討 論

小麥白粉病是大區(qū)流行病害，四川盆地及其西部山區(qū)是小麥白粉病的常發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)[11]，分析該地區(qū)小麥白粉病菌群體的毒性結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化，了解四川省小麥白粉病抗性基因的抗性現(xiàn)狀，對(duì)于整個(gè)西南地區(qū)乃至東部地區(qū)小麥白粉病的流行預(yù)測(cè)和防治都有至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，小麥抗白粉病基因Pm1a、Pm2、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm19、Pm30抗性較差，其毒性頻率已超過(guò)60%，不適合在四川省抗病育種和生產(chǎn)上繼續(xù)使用。而攜帶有Pm1c、Pm12、Pm16、Pm21和Pm24的品種和抗源均可在育種或生產(chǎn)上應(yīng)用，其毒性頻率變化范圍為0～20%，這與小麥白粉病全國(guó)大區(qū)流行趨勢(shì)基本一致[12-14]。作為我國(guó)目前抗白粉病譜最廣的基因，Pm21已被成功轉(zhuǎn)入到許多小麥品種中，且在多個(gè)省份或區(qū)域中表現(xiàn)為免疫[15-17]。近十年對(duì)Pm21表現(xiàn)毒性菌株的報(bào)道時(shí)有發(fā)生[11,18-20]。本研究未監(jiān)測(cè)到對(duì)Pm21表現(xiàn)出有毒性的菌株，后期應(yīng)繼續(xù)關(guān)注。

除了受大區(qū)流行趨勢(shì)的影響，小麥白粉病菌還呈現(xiàn)區(qū)域流行特點(diǎn)。本研究中，Pm3d、Pm13、Pm1c、Pm12、Pm16和Pm24，在盆地西部和盆地東部的毒力頻率差異較大，其原因可能與各地區(qū)小麥品種的選擇壓力有關(guān)。特有毒性類型的大量存在，表明各地區(qū)的病菌都在以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐姆绞竭M(jìn)行獨(dú)立的進(jìn)化，而盆地西部病菌群體毒性類型更多，毒性譜變化范圍更廣，毒性多樣性指數(shù)更高，除了與各地區(qū)小麥品種的選擇壓力有關(guān)外，還可能與盆地西部、川西北、隴南越夏菌源交流有關(guān)，值得進(jìn)一步的研究。