陳增菊，王 婷，湯春蕾，趙夢(mèng)鑫，康振生，王曉杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)為活體專性寄生真菌，其引起的小麥條銹病破壞性極強(qiáng)，給小麥生產(chǎn)造成重大損失[1-2]。效應(yīng)蛋白由病原物分泌，可轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)寄主植物細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)改變寄主植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝途徑調(diào)控寄主的防御反應(yīng)，促進(jìn)病菌的成功侵染或觸發(fā)寄主的防衛(wèi)反應(yīng)[3]。

病原真菌定殖于寄主植物后，被寄主的免疫系統(tǒng)識(shí)別，觸發(fā)寄主植物的最初防御反應(yīng)。病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs )包括細(xì)菌的鞭毛蛋白、真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)等病原菌保守分子[4-5]。病原真菌與寄主植物接觸后，其幾丁質(zhì)聚合物與植物細(xì)胞中的幾丁質(zhì)酶識(shí)別，觸發(fā)寄主植物的第一道防御反應(yīng)。類似于這類由模式識(shí)別受體(PRRs)觸發(fā)的第一道防衛(wèi)反應(yīng)被稱為PAMPs引起的免疫反應(yīng)(PAMPs-triggered immunity，PTI)[6]。該過(guò)程使寄主植物產(chǎn)生一系列快速響應(yīng)機(jī)制，包括活性氧及胼胝質(zhì)等物質(zhì)的積累，這些響應(yīng)程序共同促進(jìn)了抗菌化合物的積累，抑制病原菌的侵染[7]。

雖然PTI作為防止病原菌侵染的第一道屏障發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但病原菌會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的毒性因子使寄主植物感病。為了抵抗病原菌進(jìn)一步侵染，寄主植物產(chǎn)生第二道屏障即效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity，ETI)。該免疫反應(yīng)由抗病蛋白識(shí)別效應(yīng)蛋白引起，觸發(fā)寄主局部的細(xì)胞壞死或超敏(HR)等反應(yīng)[8]。寄主植物自身可產(chǎn)生壞死阻遏病原菌蔓延，誘發(fā)寄主一系列的變化，激活下游防衛(wèi)基因的表達(dá)，激發(fā)植株自身系統(tǒng)性獲得抗性[9-10]。植物病原菌的許多效應(yīng)蛋白均可抑制寄主植物的PTI或者ETI，說(shuō)明病原菌效應(yīng)蛋白對(duì)調(diào)控寄主免疫反應(yīng)具有重要作用[11-13]。

由于小麥條銹菌毒性小種變異快，容易導(dǎo)致抗病品種抗病性“喪失”，造成病害流行，因而對(duì)小麥條銹菌毒性機(jī)制以及小麥與條銹菌互作機(jī)制的研究是目前亟待解決的問(wèn)題[14]。本研究從小麥條銹菌吸器轉(zhuǎn)錄組中獲得一個(gè)在吸器特異誘導(dǎo)表達(dá)的分泌蛋白(效應(yīng)蛋白)基因Hasp58，在煙草細(xì)胞胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)該效應(yīng)蛋白以明確其毒性功能；用煙草的細(xì)胞定位明確其空間表達(dá)特征；用細(xì)菌的三型分泌系統(tǒng)在小麥中瞬時(shí)表達(dá)該效應(yīng)蛋白以明確其是否抑制植物免疫反應(yīng)，了解效應(yīng)蛋白Hasp58在條銹菌致病和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的毒性功能，為揭示該效應(yīng)蛋白的致病機(jī)理及制定新的抗病策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

煙草品種為本氏煙(Nicotianabenthamiana)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院吳云峰教授饋贈(zèng)。小麥品種分別為攜帶抗病基因YrSu的水源11以及對(duì)條銹菌高度感病的明賢169；小麥條銹菌CYR23生理小種；工程菌株為大腸桿菌(Eschrichiacoli)JM109和Top10(LB 37 ℃培養(yǎng))；農(nóng)桿菌菌株(Agrobactriumtumefacien)GV3101(LB 28 ℃培養(yǎng))；載體材料為重組馬鈴薯X病毒(PVX)載體pGR106和用于煙草細(xì)胞定位試驗(yàn)的pCAMNIA1302；均由本實(shí)驗(yàn)室保存。熒光假單胞菌菌株EtHAn(KB 28 ℃培養(yǎng))和用于細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的小麥瞬時(shí)表達(dá)的pEDV6載體，由華盛頓州立大學(xué)Scot H. Hulbert教授饋贈(zèng)。

1.2 小麥條銹菌 Hasp58的序列預(yù)測(cè)及擴(kuò)增

使用SignalP 4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)效應(yīng)蛋白Hasp58的信號(hào)肽。用Primer Premier 5設(shè)計(jì)Hasp58相關(guān)引物(表1)，以條銹菌生理小種CYR32侵染的小麥葉片的cDNA為模板分別擴(kuò)增Hasp58相關(guān)序列?；驍U(kuò)增體系為12.5 μL的2×Taq MasterMix(CWBIO)，11.5 μL的H2O，0.5 μL的正向引物，0.5 μL的反向引物。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 2 min，40 cycles；72 ℃10 min。

1.3 載體構(gòu)建及浸染煙草

以pGR106-Hasp58-F和pGR106-Hasp58-R擴(kuò)增Hasp58全長(zhǎng)；構(gòu)建pMD18-T-Simple載體；用Cla I(Fermentas)和Sal I(Fermentas)對(duì)pGR106和含有目的基因的pMD18-T-Simple重組載體進(jìn)行酶切，獲得含有酶切位點(diǎn)的目的基因與pGR106；用T4 DNA Ligase將酶切開(kāi)的目的基因與酶切開(kāi)的pGR106連接，構(gòu)建重組載體Hasp58-pGR106。重組載體電轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌感受態(tài)Gv3101及侵染煙草參照Rajput等的方法[15]。Avr1b-pGR106、GFP-pGR106、BAX-pGR106載體構(gòu)建方法同Hasp58-pGR106載體構(gòu)建。

1.4 效應(yīng)蛋白Hasp58的煙草細(xì)胞定位分析

以pCambia1302-Hasp58-NcoI-F和pCambia1302-Hasp58-SpeI-R擴(kuò)增Hasp58全長(zhǎng)(編碼蛋白為Hasp58)，以pCambia1302-Hasp58-nosp-NcoI-F和pCambia1302-Hasp58-SpeI-R擴(kuò)增Hasp58-nosp(未含有Hasp58信號(hào)肽序列，編碼蛋白為Hasp58-nosp，為缺失信號(hào)肽缺失體)，構(gòu)建pCAMNIA1302重組載體Hasp58-pCAMNIA1302、Hasp58-nosp-pCAMNIA1302(載體構(gòu)建方法同1.3)，在煙草細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白Hasp58-GFP、Hasp58-nosp-GFP。農(nóng)桿菌感受態(tài)Gv3101的制備與轉(zhuǎn)化及侵染煙草參照Cheng等[16]的方法。48 h后撕取煙草下表皮，0.8 mol·L-1山梨醇侵泡15 min進(jìn)行質(zhì)壁分離，OlympusBX-53熒光顯微鏡觀察。

1.5 效應(yīng)蛋白Hasp58對(duì)寄主PTI和ETI瞬時(shí)表達(dá)效應(yīng)測(cè)定

以pEDV6-Hasp58(nosp)-F和pEDV6-Hasp58(nosp)-R擴(kuò)增Hasp58-osp，構(gòu)建pEDV6重組載體(Hasp58nosp-pEDV6)(載體構(gòu)建方法同1.3)。重組載體轉(zhuǎn)化至熒光假單胞EtHAn參照Cheng等[17]的方法。所得熒光假單胞EtHAn培養(yǎng)液用10 mM MgCl2溶液處理，處理方法參照Cheng等[17]的方法。將處理好的菌液用10 mM MgCl2溶液稀釋至OD600為1.0，室溫放置2 h。

1.5.1 胼胝質(zhì)(Callose)積累的觀察

用處理好的熒光假單胞菌EtHAn侵染小麥明賢169，25 ℃培養(yǎng)。24 h后采集葉片，用無(wú)水乙醇∶冰醋酸(1∶1)脫色液脫色、水飽和氯醛透明、0.05%苯胺藍(lán)染液染色，熒光顯微鏡觀察胼胝質(zhì)積累。每個(gè)樣品隨機(jī)選取50個(gè)1 mm2的視野，統(tǒng)計(jì)胼胝質(zhì)的點(diǎn)數(shù)，三次生物學(xué)重復(fù)。

1.5.2 活性氧積累、細(xì)胞壞死及條銹菌菌絲發(fā)育的觀察

用處理好的熒光假單胞菌EtHAn侵染小麥水源11，24 h后接種條銹菌無(wú)毒性生理小種CYR23，接種后24 h、48 h采集葉片。

將所采集葉片于3,3-二氨基聯(lián)苯(3,3′-diaminobenzidine，DAB)中光照6～8 h染色；浸泡于脫色液中脫色，在水飽和氯醛溶液中透明；顯微鏡觀察H2O2積累和細(xì)胞壞死情況。每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)30個(gè)侵染點(diǎn)，三次生物學(xué)重復(fù)。

將所采集葉片脫色、透明后，加入1.0 M的KOH溶液，121 ℃高壓滅菌5 min，ddH2O沖洗2次，50 mM的Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液浸泡30 min，WGA-Alexa 488熒光染料染色30 min，50 mM的Tris-HCl緩沖液和ddH2O沖洗，浸泡于50%甘油中保存，顯微鏡觀察菌絲長(zhǎng)度及菌落面積。每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)30個(gè)侵染點(diǎn)，三次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hasp58的序列分析

在吸器特異誘導(dǎo)表達(dá)的分泌蛋白(效應(yīng)蛋白)基因Hasp58的cDNA序列全長(zhǎng)1 026 bp(圖1)，編碼342個(gè)氨基酸(圖2)。使用Signal P 4.1 Server對(duì)Hasp58預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其信號(hào)肽位于N端的1～26個(gè)氨基酸的位置(圖2)。

2.2 Hasp58抑制細(xì)胞壞死的毒性功能分析

用攜帶重組載體(基因-pGR106)的農(nóng)桿菌侵染煙草，24 h后注射入BAX(小鼠細(xì)胞調(diào)亡前體蛋白)，6 d后照相。如圖3所示，空載體PVX和eGFP為陰性對(duì)照，均不抑制壞死；大豆疫霉的Avr1b為陽(yáng)性對(duì)照，抑制BAX誘導(dǎo)的壞死。效應(yīng)蛋白Hasp58抑制BAX誘導(dǎo)的PCD，說(shuō)明其具有潛在的毒性功能。

表1 試驗(yàn)用引物Table 1 Primers used in this test

圖1 Hasp58的cDNAFig.1 cDNA of Hasp58

下劃線部分為信號(hào)肽 The underlined part is the signal peptide.

圖2Hasp58的氨基酸序列

Fig.2AminoacidsequenceofHasp58

2.3 Hasp58的煙草細(xì)胞定位分析

將缺失信號(hào)肽Hasp58-nosp和Hasp58分別與GFP在煙草細(xì)胞中融合表達(dá)。如圖4，質(zhì)壁分離后，GFP在煙草細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核有分布，Hasp58-nosp-GFP和Hasp58-GFP均在胞質(zhì)中分布，說(shuō)明Hasp58定位在煙草細(xì)胞胞質(zhì)。

2.4 Hasp58表達(dá)后寄主植物的胼胝質(zhì)沉積分析

將Hasp58nosp-pEDV6在熒光假單胞菌EtHAn中表達(dá)后，細(xì)菌通過(guò)其三型分泌系統(tǒng)將Hasp58nosp分泌到小麥明賢169葉片中，胼胝質(zhì)作為PTI的代表。胼胝質(zhì)的分布情況如圖5，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6。DsRed和AvrRpt2分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。如圖6所示，與陰性對(duì)照dsRed對(duì)比，用含有重組蛋白Hasp58菌液處理的小麥明賢169，其葉片胼胝質(zhì)點(diǎn)數(shù)顯著性降低，說(shuō)明該效應(yīng)蛋白可以抑制小麥的PTI反應(yīng)。

圖3 Hasp58可以抑制BAX誘導(dǎo)的PCDFig.3 Hasp58 inhibits BAX-induced PCD

圖4 Hasp58定位在胞質(zhì)(紅色箭頭為質(zhì)壁分離位點(diǎn))Fig.4 Localization of Hasp58 in cytoplasm(red arrows indicate the plasmolysis sites)

2.5 Hasp58表達(dá)后寄主植物的活性氧積累、細(xì)胞壞死及條銹菌菌絲發(fā)育分析

同2.4，小麥條銹菌Hasp58及對(duì)照蛋白表達(dá)后，活性氧積累和細(xì)胞壞死面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖8和圖9，菌絲長(zhǎng)度以及菌落面積大小如圖10。同對(duì)照dsRed對(duì)比，注射效應(yīng)蛋白Hasp58 48 h后，小麥葉片細(xì)胞壞死面積和活性氧積累顯著減少，表明效應(yīng)蛋白Hasp58可以抑制小麥的ETI反應(yīng)。同對(duì)照dsRed相比，注射效應(yīng)蛋白Hasp58 48 h后，條銹菌的菌絲面積顯著性增加，注射該效應(yīng)蛋白48 h和24 h后的菌絲長(zhǎng)度及24 h后的菌絲面積均增加，表明效應(yīng)蛋白Hasp58可以促進(jìn)條銹菌的生長(zhǎng)。

圖5 熒光顯微鏡下AvrRpt2、dsRed和效應(yīng)蛋白Hasp58的胼胝質(zhì)積累(標(biāo)尺：200 μm)Fig.5 Callose deposition of AvrRpt2,dsRed and effector Hasp58 under fluorescence microscope(bars：200 μm)

**:與dsRed差異在0.01水平顯著。

**:Significant difference with dsRed at 0.01 level.

圖6AvrRpt2、dsRed和效應(yīng)蛋白Hasp58胼胝質(zhì)積累差異

Fig.6DifferenceofcallosedepositsofdsRed,AvrRpt2andeffectorHasp58

3 討 論

效應(yīng)蛋白是一類由病原菌分泌的小分子蛋白，通過(guò)抑制寄主的免疫反應(yīng)促其致病,是病原物侵染寄主的關(guān)鍵毒性因子。目前，許多病原物的效應(yīng)基因被鑒定并確定功能，僅少數(shù)銹菌的效應(yīng)基因被鑒定，被鑒定的銹菌效應(yīng)蛋白主要來(lái)自亞麻銹菌等其他幾種銹菌[18-19]。Hasp58為小麥條銹菌吸器特異誘導(dǎo)表達(dá)的分泌蛋白，為新挖掘的效應(yīng)基因編碼蛋白，研究其在小麥條銹菌致病過(guò)程中的作用可為制定新的抗病策略奠定基礎(chǔ)。

BAX誘導(dǎo)產(chǎn)生的PCD與植物產(chǎn)生的HR相似，近年來(lái)被廣泛用于效應(yīng)蛋白的毒性功能研究[20-22]。本研究借助煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)條銹菌效應(yīng)蛋白Hasp58能夠抑制煙草PCD，確定其潛在的毒性功能。

圖7 效應(yīng)蛋白Hasp58抑制小麥的ETI反應(yīng)的組織學(xué)觀察(標(biāo)尺：200 μm)Fig.7 Histological observation of Hasp58 suppressing ETI(bars:200 μm)

*:Hasp58與陰性對(duì)照dsRed差異在0.05水平顯著。下圖同。

*:Difference between the Hasp58 and the negative control dsRed was significant at 0.05 level. The same in figures 9 and 10.

圖8條銹菌效應(yīng)蛋白Hasp58對(duì)小麥ETI反應(yīng)活性氧積累的影響

Fig.8EffectofPsteffectorHasp58ontheaccumulationofactiveoxygeninETIreaction

圖9 條銹菌效應(yīng)蛋白Hasp58對(duì)小麥ETI反應(yīng)HR積累的影響Fig.9 Effect of Pst effector Hasp58 on the accumulation of HR in ETI reaction

A：菌絲面積；B：菌絲長(zhǎng)度。A:Hypha area; B:Hypha length.

病原菌效應(yīng)蛋白分為胞內(nèi)效應(yīng)蛋白和胞外效應(yīng)蛋白，胞內(nèi)效應(yīng)蛋白可以被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)寄主細(xì)胞中發(fā)揮功能[23]。含有RXLR和CRN基序的卵菌效應(yīng)蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)寄主細(xì)胞胞內(nèi)[24]。本試驗(yàn)通過(guò)煙草的細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)確定Hasp58定位在植物細(xì)胞胞內(nèi)，說(shuō)明其在細(xì)胞胞內(nèi)定位并具有潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

PTI是病原分子相關(guān)模式誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，為先天抗病性，是寄主防御病原物的第一層屏障。卵菌和細(xì)菌的許多效應(yīng)基因均可以通過(guò)不同的機(jī)制抑制寄主的PTI[25-26]。細(xì)菌的某些效應(yīng)基因編碼效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)為PTI防衛(wèi)信號(hào)通路的相關(guān)蛋白[27]。小麥條銹菌效應(yīng)蛋白PSTha5a23在小麥與條銹菌互作中抑制寄主的PTI[17]。Hasp58為條銹菌吸器分泌蛋白，說(shuō)明病原菌已經(jīng)突破寄主的第一道屏障，產(chǎn)生吸器，分泌Hasp58發(fā)揮功能。本研究結(jié)果表明，Hasp58可抑制寄主的PTI，這可能是因?yàn)镠asp58在突破寄主第一道屏障前通過(guò)靶標(biāo)病原物的相關(guān)蛋白傳遞信號(hào)，發(fā)揮抑制寄主PTI的毒性功能。

ETI是寄主防御病原物的第二層屏障，病原物的效應(yīng)基因編碼產(chǎn)物可以通過(guò)靶標(biāo)相關(guān)蛋白，激活相關(guān)信號(hào)通路，抑制寄主的ETI反應(yīng)[12，28]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hasp58可以抑制寄主的ETI并促進(jìn)自身侵染，推測(cè)其可能通過(guò)靶標(biāo)寄主防御信號(hào)通路的蛋白發(fā)揮其抑制寄主ETI的毒性功能。本研究結(jié)果可為揭示小麥條銹菌致病機(jī)理及制定防治小麥條銹菌策略奠定基礎(chǔ)。