王戰(zhàn)士， 楊小榮，任黎剛，張心男，孫 庭

(1.浙江省立同德醫(yī)院 泌尿外科， 浙江 杭州 310012；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，江西 南昌330006)

腎癌(renal carcinoma)是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其主要病理類型為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，發(fā)病率約占腎癌的85%[1-2]。目前腎癌的主要治療方法是外科手術(shù)切除，但轉(zhuǎn)移性腎癌預(yù)后較差，且對(duì)放化療等治療不敏感，5年存活率低于5%[3]。分子靶向藥物(如舒尼替尼等)已廣泛用于晚期轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌，然而藥物的不良反應(yīng)及高昂醫(yī)療費(fèi)用限制了其臨床應(yīng)用。表觀遺傳調(diào)節(jié)異常是腫瘤發(fā)生(包括ccRCC)的重要機(jī)制[4]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1, LSD1)又稱KDM1或AOF2，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶，屬于黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性的H3K4特異性去甲基胺氧化酶家族[5]，與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LSD1在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，本文以LSD1為靶點(diǎn)，觀察其特異性抑制劑反苯環(huán)丙胺(tranylcypromine，TCP)對(duì)人腎癌786-O細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 TCP購(gòu)自英國(guó)ACROS公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司，PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司，MTT、RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利Anthos公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人腎癌786-O細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞所，接種于含10 %胎牛血清(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃、5 %CO2，將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行研究。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL。培養(yǎng)24 h后，吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度 TCP，每孔200 μL。空白對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加相同體積的1 ‰DMSO (PBS稀釋)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入5 mg/mL MTT溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用移液器吸凈孔內(nèi)液體，再加入DMSO 150 μL，水平搖床上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定OD值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-加藥組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)24 h后，吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為0、10、40、80、160 μM TCP，空白對(duì)照組加入培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加1‰DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Annexin V-FITC/PI雙染技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)十正常細(xì)胞數(shù))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCP對(duì)786-O細(xì)胞增殖的影響 TCP作用24、48、72 h后，10 μM組與0 μM組和1‰DMSO組OD值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)、藥物濃度的增大，抑制作用隨之增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)；TCP 48 h的IC50值為67.66 μM；見(jiàn)表1。

表1 TCP對(duì)786-O細(xì)胞增殖的影響(n=6)

注：*與0 μM TCP組比較，P<0.05。

2.2 TCP對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的影響 TCP作用腎癌786-O細(xì)胞48 h，與0 μM組比較，DMSO組和10 μM組凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著濃度的增高，與0 μM組比較，40 μM、80 μM、160 μM組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 不同濃度TCP誘導(dǎo)786-O細(xì)胞48 h凋亡情況

*與0 μMTCP組比較，P<0.05。圖2 不同濃度TCP誘導(dǎo)786-O細(xì)胞48 h的凋亡率比較

3 討論

組蛋白賴氨酸甲基化是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的一個(gè)關(guān)鍵因素[7]。LSD1能促進(jìn)包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制細(xì)胞凋亡，抑制其表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。Lv等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與正常的肺組織相比，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中LSD1的表達(dá)量顯著增高，且其表達(dá)量和NSCLC患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)；同時(shí)LSD1的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)。Jin等[10]構(gòu)建質(zhì)粒將LSD1 基因shRNA轉(zhuǎn)入人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116中，沉默LSD1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LSD1缺失可引起體內(nèi)體外細(xì)胞增殖的下調(diào)，認(rèn)為L(zhǎng)SD1可能是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要因素之一。Kashyap等[11]發(fā)現(xiàn)LSD1在前列腺癌LnCaP、LnCaP:C42和PC3細(xì)胞中高表達(dá)，應(yīng)用siRNA技術(shù)敲除LSD1基因可以降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平；帕吉林和反苯環(huán)丙胺能有效抑制前列腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，降低前列腺癌的復(fù)發(fā)。Lan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，LSD1在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯升高，敲除LSD1可以顯著抑制膀胱癌細(xì)胞系的增殖；且LSD1水平與惡性程度呈正相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LSD1在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)。

TCP是一種單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)抑制劑，能夠通過(guò)與FAD的輔基共價(jià)結(jié)合形成共價(jià)復(fù)合物而抑制LSD1的活性[13]。LSD1是 Mi-2/核小體重塑(NuRD)、組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)復(fù)合體的一個(gè)重要組成部分，LSD1/NuRD復(fù)合體可以通過(guò)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的催化活性來(lái)抑制基因轉(zhuǎn)錄，能夠調(diào)控多種信號(hào)通路，包括TGF-β1信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)等過(guò)程的調(diào)節(jié)[14]。Schenk等[15]用NOD/SCID -IL-2受體-γ缺陷型(NSG)小鼠模型研究LSD1抑制劑TCP和全反式視黃酸(ATRA)聯(lián)合治療非早幼粒細(xì)胞白血病，結(jié)果顯示TCP能顯著下調(diào)H3K4me2蛋白的表達(dá)水平，提高全反式維甲酸的療效。Huang等[16]在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞株中聯(lián)合應(yīng)用LSD1抑制劑(TCP、優(yōu)降寧)和HDAC1/2抑制劑(TSA)，結(jié)果顯示它們能夠使H3K4me2和AcH3K9表達(dá)水平提高，表現(xiàn)出對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用。本研究結(jié)果顯示，TCP對(duì)腎癌786-O細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。

E2F1是細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子E2F家族成員之一，參與多種轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。抑制LSD1表達(dá)可調(diào)控E2F1和組蛋白H3K4甲基化，下調(diào)Bcl-2、Bcl-1和procaspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖[17]。Ma等[18]報(bào)道E2F1在786-O和A498細(xì)胞系中高表達(dá)，能加速細(xì)胞周期中的G1/S轉(zhuǎn)換，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究采用流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)顯示，隨TCP濃度的增高，786-O細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡比例都逐漸增加，提示TCP能夠抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且呈時(shí)間-劑量依賴性。另外，本研究結(jié)果還顯示，且隨TCP藥物濃度增高，細(xì)胞壞死率也增高，提示TCP具有一定的細(xì)胞毒性。

綜上，TCP可抑制人腎癌786-O細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，后續(xù)將進(jìn)一步研究TCP對(duì)LSD1mRNA和蛋白表達(dá)的影響，對(duì)786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲活性的影響，并對(duì)其相關(guān)通路進(jìn)行研究。