麻金金 葛蓓孛 施李鳴 劉炳花 韋秋合 張克誠

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所 農業(yè)部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京 100193）

植物生長調節(jié)劑是人們根據植物激素的結構、功能或作用原理通過化學合成或從生物中提取得到的一大類物質［1］。在農業(yè)生產上主要有提高產量、改善品質、增強抗逆性以及延長儲藏期和水果保鮮等作用。目前國內登記的植物生長調節(jié)劑品種有40多種，產品多達960個（中國農藥信息網，2017年12月）。植物生長調節(jié)劑的合理使用在農業(yè)生產中發(fā)揮了重要的作用。徐長寶［2］在進行柿種子發(fā)芽實驗時使用500 mg/L的赤霉素溶液處理種子，其發(fā)芽率提高了34.7%，發(fā)芽勢提高了27.8%，發(fā)芽期也提前了8 d；宋文［3］將葡萄砧木的基部放在適當的NAA溶液中浸泡后進行嫁接，使其成活率提高了10%-20%。然而Mao等［4］在植物生長調節(jié)劑的毒性實驗中已經證明2，4-D、NAA和BNOA等有機化合物具有一定毒性，這些化學物質長期積累在食物和環(huán)境中可能會造成急性或慢性中毒。據農業(yè)部統計全國每年植物生長調節(jié)劑使用量約3 000 t，其中在水果生產中使用廣泛，且用量較大［5］。但目前市場上絕大多數植物生長調節(jié)劑是化學合成的，生物源的僅占2%-3%［6］，因此生物源植物生長調節(jié)劑的開發(fā)對綠色、安全的生態(tài)農業(yè)的發(fā)展十分重要。

鏈霉菌屬是一類重要的生防菌［7］，其次級代謝不僅能產生各種抗生素，而且能夠產生植物激素類物質如生長素、赤霉素等［8］，有研究報道大多數細菌在次級代謝過程中都能產生如生長素、赤霉素、嗜鐵素等物質來促進植物的生長［9］。本實驗中的玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259（Streptomyces roseoflavusstrain NKZ-259）是由實驗室前期分離獲得，研究發(fā)現該菌株次級代謝能產生吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），其發(fā)酵液對辣椒、番茄和小麥等的生長具有明顯的促進作用［10］。IAA屬于植物生長素類物質，是植物生長過程中分泌的調節(jié)植物生長的信號物質，能夠促進細胞生長、種子發(fā)芽和作物生根等［11］。尤桂春等［12］以500 mg/L的IAA溶液處理檸檬枝條，扦插50 d后其生根率達到90.8%，與對照相比增加了33.9%；王非等［13］使用20 mg/L的IAA處理齒葉鐵線蓮種子使其發(fā)芽率達到了93.4%，平均發(fā)芽時間縮短了3 d。Aminullah等［14］在研究IAA對大豆產量及品質的影響時發(fā)現：在大豆出苗后15 d施用10 mg/L 的IAA，豆子的產量比未噴施IAA增加了20%，豆子的品質也達到最優(yōu)水平，此外IAA在誘導番茄單性結實、提高坐果率等方面也發(fā)揮了重要的作用。

目前關于玫瑰黃鏈霉菌的報道大多是農用抗生素的挖掘及其防病機制研究［15］，也有關于芽孢桿菌等細菌產生促生類物質如細胞分裂素、生長素的報道，但大多是通過研制活菌制劑發(fā)揮微生物對作物生長的作用，然而大田中活菌制劑的使用常易受活菌數及氣候環(huán)境等的影響，效果不穩(wěn)定。微生物源植物生長調節(jié)劑是通過篩選某些在其次級代謝過程中能夠產生促生類物質的微生物，通過發(fā)酵技術、分離純化技術等最終獲得較為純凈的物質開發(fā)成制劑用于農業(yè)生產，而目前對于微生物源植物生長調節(jié)劑開發(fā)的報道較為少見，因此我們期望通過分離提取該菌株代謝產生的IAA來開發(fā)微生物源植物生長調節(jié)劑。微生物次級代謝產物成分復雜且含量極低，因此開發(fā)微生物源的植物生長調節(jié)劑，次級代謝產物的含量的提高是關鍵的一步。本研究將通過對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，進一步提高菌株次級代謝產生IAA的含量，從而為后期IAA的分離純化及制劑開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259（Streptomyces roseoflavusstrain NKZ-259），由中國農業(yè)科學院植物保護研究所農用抗生素組保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 菌種培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，配方參考葛蓓孛等［16］；種子培養(yǎng)基配方參考侯曉平等［17］；原始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨4 g，酵母膏2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀2 g，無菌水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵液制備 將保存的玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259接種在MS培養(yǎng)基上于28℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d，用無菌牙簽劃下1 cm2大小的菌塊接種于種子培養(yǎng)基，28℃，200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)48 h。取1%種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，220 r/min搖床震蕩培養(yǎng)96 h，濾紙過濾后即得發(fā)酵液。

1.2.2 IAA的定性檢測 取1.2.1 制備的發(fā)酵液按體積比1∶1與salkowski比色液（50 mL 35%HCL+1 mL 0.5 mol/L）混合進行顯色反應，同時以50 g/mL IAA標準溶液做對照，放置于25℃、黑暗條件下靜置30 min，觀察顏色變化，顏色變?yōu)榉奂t色表示有IAA 產生［18-19］。

1.2.3 IAA的定量檢測 IAA標準曲線的制作參考吳翔等的方法［20］。取1.2.1 制備的發(fā)酵液2 mL與等體積salkowski比色液混合，以未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基與salkowski比色液等體積混合作為對照，室溫避光放置30 min，測定其OD530。通過IAA標準曲線計算發(fā)酵液中IAA的濃度。

1.2.4 IAA發(fā)酵培養(yǎng)基的單因子試驗 IAA發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源的篩選：分別以2% 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為單一碳源代替礎培養(yǎng)基中的碳源；以2%葡萄糖作為速效碳源，分別添加2%蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和1%可溶性淀粉作為復合碳源，搖床28℃、200 r/min發(fā)酵96 h后測定各發(fā)酵液中IAA濃度。

IAA發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源的篩選：由于原始培養(yǎng)基中有蛋白胨和酵母膏兩種有機氮源，缺少無機氮源，因此分別以2%黃豆面、牛肉膏、玉米粉代替基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨，再以0.4%的硫酸銨、氯化銨和硝酸鉀代替基礎培養(yǎng)基中的酵母膏作為無機氮源，發(fā)酵條件及IAA測定方法同上。

IAA發(fā)酵培養(yǎng)基最適無機鹽的篩選：在原始培養(yǎng)基中分別添加0.04%氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鎂和硫酸鋅作為無機鹽，發(fā)酵條件及IAA的測定方法同上。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗設計 Plackett-Burman法篩選顯著影響因子 使用Minitab17軟件，選用n = 6的Plackett-Burman法對單因子試驗確定的6個成分設計12次試驗進行考察，以X1、X2、X3、X4、X5、X6分別代表葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硝酸鉀、磷酸氫二鉀和L-色氨酸，每個因素取高低兩個水平，分別以1和-1表示（表1），每組試驗設計三組平行試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設計中2因子水平列表

中心組合設計（Central composite design，CCD）優(yōu)化關鍵影響因子 對Plackett-Burman法設計篩選出的3個顯著影響因子，應用Design-expert 7.0.6軟件設計3因素5水平，20次的試驗（表2），每組實驗3次重復，并進行響應面分析。

表2 中心組合設計各因子水平列表

2 結果

2.1 發(fā)酵液中IAA的檢測

通過salkowski比色實驗，明確了玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259次級代謝過程能夠產生IAA，以OD530為橫坐標（x），IAA濃度為縱坐標（y）制作標準曲線，得到線性回歸方程y=38.971x+2.282 3，r=0.988 1，在所測濃度范圍內線性關系良好，根據標準曲線得到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中IAA的含量是11.64 g/mL。

2.2 IAA發(fā)酵培養(yǎng)基的單因子試驗

試驗分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為單一碳源，發(fā)現NKZ-259菌株對可溶性淀粉的利用率最高，發(fā)酵產生IAA含量最高（圖1），以可溶性淀粉和葡萄糖組成復合碳源時，比單一碳源發(fā)酵產生的IAA含量更高（圖2），因此選用葡萄糖和可溶性淀粉作為培養(yǎng)基中的最佳碳源；氮源一般分為無機氮源和有機氮源，選用黃豆面、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米粉作為無機氮源，硫酸銨、氯化銨和硝酸鉀作為有機氮源進行試驗，發(fā)現當NKZ-259菌株以蛋白胨為有機氮源、硝酸鉀為無機氮源時IAA的產量明顯增高（圖3），因此采用蛋白胨和硝酸鉀作為培養(yǎng)基中的最適氮源；無機鹽也是微生物生長所不可缺少的成分，分別選用氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鎂和硫酸鋅進行試驗發(fā)現：當加入磷酸氫二鉀時，IAA的產量最高（圖4），最終選擇磷酸氫二鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適無機鹽。

圖1 不同單一碳源對發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖2 不同復合碳源對發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖3 不同氮源對發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖4 不同無機鹽對發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖5 標準化效應Pareto圖（響應為IAA含量，α＜0.05）

2.3 Plackett-Burman法篩選顯著影響因子

根據Plackett-Burman法設計六因素、兩水平表并配制培養(yǎng)基進行試驗，每組試驗做3次重復，實驗數據分析使用Mintab17軟件。以菌株發(fā)酵液中IAA的含量作為響 應值，建立一次回歸方程：IAA含量 = 15.487+2.080X1-0.063X2-0.069X3+0.184X4+1.830 X5+5.839X6。

模型回歸決定系數R=98.83%，校正系數R（調整）=97.43%，表明真實值與預測值相關性極高，且回歸模型P=0.000＜0.05，差異達到極顯著水平，因此，該數學模型可用于評價本試驗各因子對響應值影響的顯著性［21］。表4中L-色氨酸、葡萄糖和磷酸氫二鉀（P＜0.05）均對預測響應值均達到顯著水平（表3-4、圖5），且其對IAA含量均具有顯著正效應，因此選用上述三個因素繼續(xù)優(yōu)化得到最大響應值。

2.4 響應面法優(yōu)化關鍵影響因素

應用Design-expert7.0.6軟件對Plackett-Burman篩選出的3個重要影響因子，采用Central composite design設計 3因素，5水平（-1.682，-1，0，1，1.682），試驗次數為20的試驗（表5）。

運用 Design-Expert 7.0.0 軟件對 20 組試驗數據進行回歸分析，得到擬合回歸方程：IAA =45.47+3.88 X6+1.71 X1+0.52 X5-0.32 X6X1-0.21 X6X5+0.092 X1X5-7.88 X62-5.82 X12-4.83 X52；經方差分析該模型極顯著（P＜0.0001），模型回歸決定系數R-sq=99.82%，R-sq（Adj）=99.66%，說明模型與實際擬合良好；模型失擬項P為 0.0694＞0.05，表明模型失擬項不顯著，因此模型選擇合適。表6中一次項（L-色氨酸、葡萄糖、磷酸氫二鉀）、二次項（X62、X12、X52）都極為顯著，三因子的交互項均不顯著，表明各因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是二次關系［22］。由此表明該回歸方程可以用來解釋各因素和響應值之間的真實關系，因此該模型可用來對菌株 NKZ-259產IAA的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行分析預測。

為了進一步了解這3個因素之間的交互作用，通過Design-Expert 7.0.0 軟件繪制響應面圖和等高線圖，等高線的形狀可反映出兩因素之間交互作用的大小，橢圓形表示兩因素的交互作用明顯，圓形表示兩因素之間的交互作用不顯著［23］。由圖6-8進一步看出：L-色氨酸、葡萄糖和磷酸氫二鉀這三個因素，兩兩之間交互作用均不明顯。根據響應面模型預測的發(fā)酵培養(yǎng)基中主要成分含量為：L-色氨酸2.24 g/L，葡萄糖20.7 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，模型預測的IAA含量為46.060 7 μg/mL。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 Plackett-Burman試驗結果分析

3 討論

利用微生物生產各種有用代謝物的一個重要方法就是微生物發(fā)酵，因此發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化尤為重要［24］。響應面法（Response surface methodology，RSM）是近年來菌株培養(yǎng)基優(yōu)化的最優(yōu)方法之一，它通過采用多元二次回歸方程來擬合各因素與響應值間的函數關系，并最終尋求最優(yōu)的工藝參數［25］。與正交實驗相比，響應面法是通過建立曲面模型來檢驗各因素及其交互作用對響應值的影響，可連續(xù)的對試驗各個水平進行分析，而且可顯著減少實驗次數、縮短試驗周期，目前已廣泛應用于化學、生物工程、食品、醫(yī)藥等領域。Li等［26］運用響應面法對乳酸乳球菌ATCC 11454發(fā)酵產細菌素的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，使該菌株發(fā)酵產生的細菌素產量增加了一倍；韓興［27］通過PB設計及響應面分析優(yōu)化玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63發(fā)酵培養(yǎng)基使抗生素產量提高了1.63倍。

IAA作為一種信號分子通過調控植物細胞分裂、器官發(fā)育及相關基因的表達來調控植物的生長，對植物的生長發(fā)育十分重要［28］，然而植物組織中產生激素類物質的含量十分有限。雖然目前已經能夠通過化學方法合成并大量生產激素類物質如IAA等，但化學合成的物質對環(huán)境和人類健康有著巨大的威脅。從微生物次級代謝物中分離提取的植物生長調節(jié)類物質來源于自然環(huán)境，能顯著降低環(huán)境中的農藥殘留及化學物質對人類健康帶來的威脅，因此微生物源植物生長調節(jié)劑的開發(fā)研究十分重要。目前已報道劉偉等［29］通過對地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高細胞分裂素的產量，并對其分離純化條件進行了研究。本研究后期將在IAA含量提高的基礎上對其進行分離純化，致力于以NKZ-259為出發(fā)菌株，探索微生物源植物生長調節(jié)劑的生產工藝，并最終開發(fā)出綠色、高效的微生物源植物生長調節(jié)劑。

表5 中心組合設計及試驗結果

圖6 L-色氨酸和葡萄糖兩因素的響應面圖和等高線圖

表6 中心組合設計回歸分析結果

圖7 L-色氨酸和磷酸氫二鉀兩因素的響應面圖和等高線圖 圖8 葡萄糖和磷酸氫二鉀兩因素的響應面圖和等高線圖

4 結論

本研究通過單因子試驗明確了菌株NKZ-259發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源、無機鹽；應用Plackett-Burman法篩選出了培養(yǎng)基中對菌株發(fā)酵產生IAA的顯著影響因子，然后通過中心組合設計（Central composite design）對Plackett-Burman篩選出的三個影響因子進行優(yōu)化并通過響應面法進行分析，最終得到菌株發(fā)酵產生IAA的最優(yōu)培養(yǎng)基為：L-色氨酸2.24 g/L，葡萄糖20.7 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨3 g/L，硝酸鉀4.5 g/L。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，3次發(fā)酵產生IAA的含量分別為45.656 0、45.023 1和45.453 2 μg/mL，平均值為45.377 4 μg/mL，與原始發(fā)酵培養(yǎng)基相比菌株產生IAA的含量提高了3倍。