李瑩瑩 崔東遙 常亞青 柳林 張寶警 姜惠婷 劉印 湛垚垚

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023）

轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 -β（Transforming growth factor，TGF-β）普遍存在于真核生物細(xì)胞中，是TGF-β超家族（Transforming growth factor superfamily）的重要成員之一。在哺乳動(dòng)物中，TGF-β主要有TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 三種不同的亞型［1］，在鳥類中存在 TGF-β4［2］，在兩棲類中存在 TGF-β5［3］。大量研究顯示，TGF-β信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附、膠原產(chǎn)生、細(xì)胞外基質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡等許多生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用［4-7］。截止到2018年5月，在美國國立生物信息中心（NCBI）中已登錄的TGF-β家族基因序列條目共有464條，其中鳥類220條，哺乳動(dòng)物69條，棘皮動(dòng)物43條，貝類21條，節(jié)肢動(dòng)物19條，硬骨魚3條，兩棲類3條及其他物種86條。

相較于鳥類和哺乳動(dòng)物而言，海洋生物TGF-β的研究仍相對(duì)較少，目前主要是關(guān)于魚類、貝類、棘皮類TGF-β基因的cDNA全長克隆、序列分析及生物功能的初步研究。例如，Ottaviani等［8］研究證實(shí)TGF-β1過表達(dá)可以誘導(dǎo)紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）血細(xì)胞的形狀變化和趨化遷移。之后，Kletsas等［9］在上述研究的基礎(chǔ)上通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)TGF-β1信號(hào)可沿磷酸肌醇（Inositol phosphate）信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳導(dǎo)，在紫貽貝體內(nèi)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。Maehr等［10］使用聚肌胞：聚胞苷酸［Polyinosinic-polycytidylic acid injection，Poly（I：C）］和脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）等刺激虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的頭腎（Head kidney，HK）巨噬細(xì)胞系，誘導(dǎo)其發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。與對(duì)照組相比，各免疫刺激劑處理組虹鱒巨噬細(xì)胞系中TGF-β1b基因的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），提示，虹鱒TGF-β1b可能參與其主要的免疫過程。在棘皮動(dòng)物中，TGF-β已被證實(shí)與海膽胚胎的對(duì)稱性生長，以及幼體骨骼的生物礦化（Biomineralization）密切相關(guān)［11-13］。

海水酸化（Seawater acidification or ocean acidification，OA）是由于海洋吸收了大氣中過量的CO2而導(dǎo)致的海水pH下降的現(xiàn)象［14-16］。大量研究證實(shí)，海水酸化對(duì)海洋生物和海洋生態(tài)系統(tǒng)有著深刻而復(fù)雜的影響［17］。海膽是海洋淺海生物的代表物種，也是研究海水酸化對(duì)海洋生物影響的模式生物之一［18］。研究發(fā)現(xiàn)，海水酸化不僅可以影響海膽骨骼的早期鈣化生長，還對(duì)不同海膽的受精、卵裂、對(duì)稱體制發(fā)育和浮游幼體存活等產(chǎn)生不同程度的影響［19-21］。胡婉彬［22］的研究顯示，與自然海水組相比，不同海水酸化條件下，馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）四腕浮游幼體中TGF-β基因的表達(dá)趨勢(shì)隨海水pH值的降低而顯著升高，且TGF-β信號(hào)通路始終位于顯著富集的差異表達(dá)信號(hào)通路的前10位，提示TGF-β基因可能在海膽浮游幼體響應(yīng)酸化海水脅迫中發(fā)揮重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物體受到外界刺激或脅迫時(shí)，可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)TGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量對(duì)外界環(huán)境刺激或脅迫作出響應(yīng)［23］。那么，TGF-β基因是否參與成體海膽響應(yīng)海水酸化脅迫的過程；不同海水酸化脅迫條件下，TGF-β基因在成體海膽中的表達(dá)模式是否發(fā)生變化，變化趨勢(shì)是否與浮游幼體相同；TGF-β基因在成體海膽響應(yīng)海水酸化中發(fā)揮何種功能，目前尚未見報(bào)道。

光棘球海膽（Mesocentrotus nudus），又稱大連紫海膽，主要分布于中國遼東半島和山東半島的黃、渤海海域，因其性腺營養(yǎng)豐富、品質(zhì)上乘，是我國北方近岸海域最主要的經(jīng)濟(jì)種類和重要的出口海產(chǎn)品種類之一［24］。為明確光棘球海膽（M.nudus）TGF-β基因的序列及結(jié)構(gòu)信息，初步探明該基因的表達(dá)模式和生物功能。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)首次獲得了光棘球海膽TGF-β基因（MnTGF-β）的cDNA全長序列，分析了該基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征，初步研究其在光棘球海膽中的組織表達(dá)規(guī)律及其在海水酸化脅迫下的表達(dá)變化情況，以期為豐富棘皮動(dòng)物TGF-β家族成員序列信息以及生物功能研究提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所需的光棘球海膽（M. nudus），平均殼徑29.33 ± 2.80 mm，采集于大連黑石礁海域（121°33'47''E，38°51'55''N）。實(shí)驗(yàn)前，暫養(yǎng)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的循環(huán)水槽（約1 000 L）中，暫養(yǎng)條件為：pH 8.06± 0.01；鹽度30.16 ± 0.14；海水溫度12.56 ± 0.13℃；充分溶氧；暫養(yǎng)期間投喂海帶（Laminaria japonica），換水周期為2 d。

選擇健康、活力好的光棘球海膽3只，分別提取其性腺、體腔液、腸、圍口膜和管足5種組織，做好標(biāo)記后立即用液氮冷凍，存放于-80℃中，用于MnTGF-β基因的克隆和組織表達(dá)規(guī)律檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 海水酸化處理 海水酸化處理使用“實(shí)驗(yàn)室模擬海水酸化系統(tǒng)”（ZL. 201320267332.7），CO2海水酸化脅迫按照文獻(xiàn)［20］中的方法進(jìn)行。根據(jù)IPCC（2013）報(bào)告的預(yù)測(cè)2100年海洋pH值［25］，設(shè)定一個(gè)自然海水組（control）和3個(gè)海水酸化實(shí)驗(yàn)組（OA1，△ pH = -0.3；OA2， △ pH = -0.4；OA3， △ pH =-0.5）。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，每組設(shè)置3個(gè)平行（n=3），共12組，每組中放入5只光棘球海膽。海水酸化處理過程中，使用pH計(jì)（HI9124，HANNA，意大利）和水質(zhì)儀（A329，Thermo，美國）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各組海水的pH、鹽度和溫度（表1）。為避免海水pH的劇烈波動(dòng)，酸化脅迫期間不投喂食物。

分別在海水酸化脅迫的第1 d、4 d和7 d，從各實(shí)驗(yàn)組中取出1只海膽，取其性腺、腸和管足3種組織，做好標(biāo)記后立即用液氮冷凍，存放于-80℃中用于探究各組織中的MnTGF-β基因在不同酸化條件下的表達(dá)變化情況。

表1 實(shí)驗(yàn)前后海水化學(xué)參數(shù)情況

1.2.2MnTGF-β基因cDNA全長的克隆 利用Trizol法提取光棘球海膽體腔液中的總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)（NanoPhotometer公司，德國）檢測(cè)RNA的完整性和濃度后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（寶生物公司，大連）試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一條鏈cDNA（反應(yīng)體積及條件參照說明書進(jìn)行）。根據(jù)紫球海膽（S.purpuratus）TGF-β2的 基 因 序 列（GenBank登 錄號(hào)：XP_793246.2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增光棘球海膽TGF-β基因核心片段的引物（表2）。使用LATaq試劑盒（寶生物公司，大連）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體 系 為 ：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）4 μL， 上 下 游 引物（10 μmol/L）各 2 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 31 μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μL）1 μL。反應(yīng)程序 ：94℃ 預(yù)變性 5 min ；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，通過膠回收試劑盒（生工，上海）回收目的片段，并連接到pEASY-T1質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中（全式金，北京），涂LB（含Amp）平板后37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。翌日挑取單菌落接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基（Amp終濃度為100 μg/mL）中振蕩培養(yǎng)，通過菌落PCR使用M13通用引物（表2）初步鑒定陽性克隆，后送至上海生物生工公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果于NCBI中進(jìn)行比對(duì)，獲得MnTGF-β基因的保守區(qū)序列，再以該序列作為模板進(jìn)行RACE片段擴(kuò)增，設(shè)計(jì)5'/3'RACE特異性外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物（表2）。5'/3'RACE反轉(zhuǎn)錄按照SMARTerTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒（Clontech公司，美國）說明書進(jìn)行，獲得RACE的cDNA模板。以RACE cDNA為模板進(jìn)行5'/3' PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，其反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、產(chǎn)物純化、克隆及序列測(cè)定方法同上述核心片段的克隆。所用引物（除通用引物）均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。

表2 用于MnTGF-β基因cDNA RACE和實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

1.2.3MnTGF-β基因序列的生物信息學(xué)分析 使用BLAST（BLASTX，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行MnTGF-β的核苷酸和氨基酸序列相似性分析；使用 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定MnTGF-β開放閱讀框（Open reading frame，ORF）及其編碼的氨基酸序列；使用ExPasy（http：//www.expasy.org/）的Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析推導(dǎo)MnTGF-β蛋白的基本理化性質(zhì)；使用SMART網(wǎng)絡(luò)工具（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行MnTGF-β蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使 用 PSIPRED v3.3（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和 PHD（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_phd.html） 預(yù)測(cè)MnTGF-β蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用同源建模法，利用 Swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/） 預(yù)測(cè)MnTGF-β蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，然后使用Swiss-Pdb Viewer4.1軟件進(jìn)行可視化圖形分析；使用MEGA 7.0和Genedoc 2.6軟件進(jìn)行TGF-β多重序列比對(duì)，在此基礎(chǔ)上，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)分析 采用Trizol法提取各組織的總RNA，檢測(cè)其RNA的完整性和濃度后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with a gDNA Eraser試劑盒（寶生物公司，大連）去除總RNA中的殘余的基因組DNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反應(yīng)體積及條件參照說明書進(jìn)行）。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差，分別將3個(gè)平行樣的RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，所有cDNA稀釋10倍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

使用 Applied Biosystems 7500（Life technologies，美國）進(jìn)行qRT-PCR以分析MnTGF-β基因的表達(dá)情況。選取18s基因?yàn)閮?nèi)參基因［26］，在qRT-PCR分析中使用的引物列于表2中。為避免實(shí)驗(yàn)誤差，每組設(shè)置3個(gè)平行（n=3）。在總體積20 μL的體系中包括2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Green Master mix，0.4 μL ROX Reference Ⅱ，6 μL ddH2O 和 0.8 μL 上、下游引物（10 μmol/L）。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30 s；95℃5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析［27］，其公式為：

-ΔΔCt=［Ct（sample）- Ct（reference）］-［Ct（control）- Ct（reference）］

DEDS的仿真模型主要有面向事件、面向活動(dòng)和面向進(jìn)程3種，它們各有不同特點(diǎn)，我們可根據(jù)不同需要選擇合適的仿真模型。仿真模型實(shí)現(xiàn)的有效方法之一是建立仿真函數(shù)庫。它的優(yōu)點(diǎn)在于建模者可以專注于模型的邏輯關(guān)系而不必?fù)?dān)心模型實(shí)現(xiàn)的細(xì)節(jié)，因此，仿真函數(shù)庫的建立需要足夠靈活，以保證其適用于各類系統(tǒng)的建模。它的基本功能模塊包括：隨機(jī)數(shù)生成、實(shí)體建模、運(yùn)行調(diào)度、隊(duì)列建模、仿真結(jié)果收集和分析。仿真函數(shù)庫首先應(yīng)有調(diào)用子程序或函數(shù)的能力，并且是通過參數(shù)傳遞來實(shí)現(xiàn)。其次，要有實(shí)時(shí)生成動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)對(duì)象的能力和能夠支持應(yīng)用預(yù)編譯模塊構(gòu)成的庫[4]。

2 結(jié)果

2.1 MnTGF-β基因全長cDNA序列及分析

利用RACE技術(shù)首次獲得光棘球海膽的TGF-β基因的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：MH178665）全長2 299 bp，開放閱讀框長度為1 290 bp，編碼430個(gè)氨基酸；5'非編碼區(qū)（5'untranslated regions，5'UTR）長度為745 bp，3'非編碼區(qū)（3'untranslated regions，3'UTR）長度為261 bp，并含有一個(gè)典型的不穩(wěn)定因素結(jié)構(gòu)ATTTA；起始密碼子（ATG）位于序列的第746 bp處，終止密碼子（TAG）位于序列的第2 036 bp處；經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)，MnTGF-β蛋白的理論分子量為48.31 kD，理論等電點(diǎn)為5.84，一個(gè)典型的TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域位于MnTGF-β蛋白的Ser318-Ser430區(qū)域（圖1）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MnTGF-β蛋白共包含16.28%的α-螺旋（helix）、26.74%的延伸鏈（strand）和56.98%的無規(guī)則卷曲（coil）（圖2）；以已知三維結(jié)構(gòu)的人的TGF-β1（Swiss-model模板號(hào)：5vqf.2.A）為模板，進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)得到MnTGF-β的氨基酸序列與人TGF-β1氨基酸序列的一致性為33.62%，兩者均具有“半胱氨酸結(jié)（Cysteine knot）”結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.2 同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

多重序列比對(duì)結(jié)果（圖4）顯示，MnTGF-β蛋白與紫球海膽（S. purpuratus）TGF-β2蛋白序列（NCBI登錄號(hào)：XP_793246.2）的同源性最高，達(dá)到97.69%；與仿刺參（Apostichopus japonicas）TGF-β2（NCBI登錄號(hào)：PIK61515.1）、大海馬（Hippocampus kuda）TGF-β1（NCBI登錄號(hào) ：ADK92394.1）、斑馬魚（Danio rerio）TGF-β1（NCBI登錄號(hào)：NP_8782-93.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）TGF-β1（NCBI登錄號(hào)：NP_001081330.1）、小鼠（Mus musculus）TGF-β1（NCBI登 錄 號(hào) ：NP_035707.1） 的 同 源 性 為21.20% 和人（Homo sapiens）TGF-β1（NCBI登錄號(hào)：AAP36538.1）的同源性為30%。

由圖5可以看出，利用MEGA7.0軟件的鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中顯示，11種生物的 TGF-β的 3個(gè)亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）（表3）各自聚為一支。其中，光棘球海膽（M. nudus）的MnTGF-β氨基酸序列與紫球海膽（S.purpuratus）的 TGF-β2 和仿刺參（A. japonicas）的TGF-β2聚為一支，其與紫球海膽TGF-β2的氨基酸序列親緣關(guān)系最近。

表3 光棘球海膽MnTGF-β氨基酸序列多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹所用物種信息

2.3 MnTGF-β基因的組織表達(dá)情況

如圖6所示，MnTGF-β基因在光棘球海膽性腺（Gonad）、體腔液（Coelomic fluid）、腸（Intestines）、圍口膜（Peritomial membrane）和管足（Tube foot）5種組織中均有表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的組織特異性。MnTGF-β基因在檢測(cè)組織中的相對(duì)表達(dá)量從高到低依次為：管足＞圍口膜＞腸＞體腔液＞性腺。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，MnTGF-β基因在光棘球海膽管足組織中的相對(duì)表達(dá)量最高且極顯著高于在性腺、體腔液、腸和圍口膜4種組織中（P＜0.01），而MnTGF-β基因在光棘球海膽性腺、體腔液和腸中的相對(duì)表達(dá)量并無顯著差異。值得注意的是，MnTGF-β基因在光棘球海膽性腺組織中的相對(duì)表達(dá)量最低，分別為管足的1.14%和圍口膜的1.53%。

2.4 不同海水酸化脅迫下光棘球海膽MnTGF-β基因的組織表達(dá)

性腺不僅是海膽的繁殖器官更是最重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，腸是海膽的主要消化器官，管足是海膽的運(yùn)動(dòng)及觸覺器官，為進(jìn)一步明確MnTGF-β基因在成體海膽應(yīng)答海水酸化脅迫中的表達(dá)規(guī)律及生物學(xué)功能，本研究以光棘球海膽的性腺、腸和管足組織為對(duì)象，探究不同海水酸化條件下成體光棘球海膽MnTGF-β基因的表達(dá)變化情況。

圖1 MnTGF-β基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

如圖7所示，酸化脅迫1 d后，OA1組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量相較于自然海水組（control）略有升高，但不具有顯著性差異；OA2組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量與自然海水組相比則呈極顯著降低趨勢(shì)（P＜0.01）；OA3組性腺組織的MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量雖略高于OA2組，但是與自然海水組相比仍然呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；酸化脅迫4 d后，相較于自然海水組而言，OA1、OA2和OA3組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.01）；酸化脅迫7 d后，OA1組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因相較于自然海水組呈現(xiàn)極顯著上調(diào)趨勢(shì)（P＜0.01），而OA2組和OA3組光棘球海膽性腺組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量與自然海水組相比均無顯著性差異。

圖2 MnTGF-β蛋白的TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖8可以看出，與自然海水組相比，酸化脅迫1 d和4 d時(shí)，OA1、OA2和OA3組光棘球海膽腸組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著下調(diào)（P＜0.01）。而酸化脅迫7 d時(shí)，OA1組光棘球海膽腸組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量與自然海水組相比呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），OA2和OA3組光棘球海膽腸組織中MnTGF-β基因與自然海水組相比依然呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.01）。

圖3 光棘球海膽MnTGF-β蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用同源克隆和RACE技術(shù)首次獲得光棘球海膽的TGF-β基因全長cDNA序列，經(jīng)生物信息分析得知，該序列編碼430個(gè)氨基酸，與紫球海膽（S. purpuratus）SpTGF-β2的同源性較高，達(dá)到97.69%，但相比SpTGF-β2氨基酸序列少了2個(gè)氨基酸，這一結(jié)果提示，MnTGF-β和SpTGF-β2在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)上可能會(huì)有所不同。值得注意的是，MnTGF-β氨基酸序列與同為棘皮動(dòng)物的仿刺參（A. japonicus）AjTGF-β2的同源性僅為24.88%，分析其原因可能是在分子進(jìn)化過程中，光棘球海膽的MnTGF-β和仿刺參的AjTGF-β2分別起源于TGF-β家族的不同亞基。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，與紫海膽SpTGF-β2的二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，兩者均具有超過50%的無規(guī)則卷曲（coil），其中，MnTGF-β蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的中α-螺旋（helix）含量較少而延伸鏈（strand）的含量較高，這可能是由于MnTGF-β相較于SpTGF-β2的氨基酸序列少了2個(gè)氨基酸造成的。同源建模預(yù)測(cè)MnTGF-β蛋白三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與人的TGF-β1蛋白相比，MnTGF-β蛋白的C末端也具有半胱氨酸組成的典型的“半胱氨酸結(jié)（Cysteine knot）”結(jié)構(gòu)。在光棘球海膽的“半胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)中，8個(gè)半胱氨酸以成對(duì)的方式形成分子中心區(qū)的4對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，結(jié)合第9個(gè)半胱氨酸形成鏈間二硫鍵一起形成TGF-β二聚體，提示，光棘球海膽的MnTGF-β可能與大海馬的TGF-β1起源于同一祖先［28］。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，8種生物的TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，均具有特征性標(biāo)志成熟肽起始的KEX-Furin樣蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)（RKRR）［29-30］和整合素結(jié)合位點(diǎn)（RGD）［31］。值得注意的是，光棘球海膽中的KEX-Furin樣蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)由RRRR取代了RKRR（粗體為差異氨基酸）。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，光棘球海膽與紫球海膽（S.purpuratus）聚為最近的一支，說明海膽的TGF-β在進(jìn)化過程中高度保守，這一關(guān)系也符合光棘球海膽的進(jìn)化和分類地位。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，選取光棘球海膽性腺、體腔液、腸、圍口膜和管足等5個(gè)組織，測(cè)定了MnTGF-β基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MnTGF-β基因在光棘球海膽管足組織中的相對(duì)表達(dá)量最高；其次為圍口膜、腸和體腔液，而在性腺組織中的相對(duì)表達(dá)量最低，這說明光棘球海膽MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)具有鮮明的組織特異性（P＜0.01）。

圖4 光棘球海膽與其他7種生物TGF-β蛋白序列的多重比對(duì)

圖5 11種生物TGF-β蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖6 MnTGF-β基因在光棘球海膽不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況

圖7 不同酸化條件下MnTGF-β在光棘球海膽性腺組織中的相對(duì)表達(dá)情況

圖8 不同酸化條件下MnTGF-β在光棘球海膽腸組織中的相對(duì)表達(dá)情況

圖9 不同酸化條件下MnTGF-β在光棘球海膽管足組織中的相對(duì)表達(dá)情況

有研究顯示，海水酸化不僅對(duì)海洋生物的早期發(fā)育有顯著影響，而且對(duì)海洋生物成體的生理生化過程也具有深刻而復(fù)雜的影響。本研究結(jié)果顯示，與自然海水組相比，在不同海水酸化脅迫下，光棘球海膽性腺、腸和管足這3種重要器官中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)變化規(guī)律各不相同，說明海膽的TGF-β基因在應(yīng)答海水酸化脅迫時(shí)具有一定的組織特異性。Dupont等［32］報(bào)道，海水酸化脅迫綠海膽（Strongylocentrotus droebachiensis）4個(gè)月后，通過計(jì)算產(chǎn)卵數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，酸化處理組的綠海膽的繁殖力降低了4.5倍，提示海水酸化對(duì)綠海膽性腺的發(fā)育和成熟具有負(fù)面效應(yīng)。Kurihara等［33］對(duì)馬糞海膽（H. pulcherrimus）酸化脅迫9個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，海水酸化可延遲馬糞海膽的性腺發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，與自然海水組相比，海水酸化脅迫4 d時(shí)，各海水酸化脅迫組光棘球海膽性腺中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)均受到顯著抑制，而海水酸化脅迫7 d時(shí)，各海水酸化脅迫組光棘球海膽性腺中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量略有回升，其中，OA1組光棘球海膽性腺中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于自然海水組（P＜0.01）。分析這一結(jié)果產(chǎn)生的原因是：本研究取樣正值光棘球海膽繁殖前期，其性腺發(fā)育相關(guān)基因正處于活躍狀態(tài)，與性腺發(fā)育密切相關(guān)的MnTGF-β基因?qū)Σ煌Ｋ峄瘲l件的響應(yīng)結(jié)果提示，急性海水酸化脅迫可能會(huì)抑制光棘球海膽的性腺發(fā)育。但是，隨著酸化脅迫時(shí)間的增長，光棘球海膽可能通過顯著地上調(diào)表達(dá)MnTGF-β基因來補(bǔ)償海水酸化對(duì)性腺發(fā)育的延滯作用，使得光棘球海膽的性腺得以正常發(fā)育，然而更為深入的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究和探索。Heuer等［34］研究表明，酸化環(huán)境會(huì)誘發(fā)海灣蟾蜍魚（Opsanus beta）發(fā)生酸中毒，由于對(duì)酸中毒的補(bǔ)償作用，引起了腸道陰離子交換的增加，對(duì)腸組織造成更大的損傷。Hu等［35］研究發(fā)現(xiàn)大西洋鱈魚（Gadus morhua）在二氧化碳較高水平的環(huán)境下，其腸組織上皮中的大多數(shù)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào)，表明海水酸化可增加大西洋鱈魚腸組織陰離子的分泌速率進(jìn)而對(duì)其腸組織造成損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與自然海水組相比，當(dāng)海水pH降低0.3個(gè)單位時(shí)，光棘球海膽腸組織MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量隨著酸化時(shí)間延長呈現(xiàn)極顯著降低而后顯著升高的趨勢(shì)，且在酸化脅迫的第7天顯著高于自然海水組（P＜0.05）；當(dāng)海水pH降低0.4和0.5個(gè)單位時(shí)，光棘球海膽腸組織MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于自然海水組（P＜0.01）。Monteleone等［36］在人類腸炎病（Inflammatory bowel diseases，IBD）的研究中指出，TGF-β是一種具有能夠提高黏膜修復(fù)能力的上皮細(xì)胞因子，在機(jī)體損傷后能促進(jìn)上皮黏膜的修復(fù)。推斷本研究結(jié)果中，不同酸化條件下光棘球海膽MnTGF-β基因在其腸道中的不同表達(dá)趨勢(shì)，可能是由于海水酸化破壞了光棘球海膽的腸道黏膜，MnTGF-β基因可能參與光棘球海膽腸道黏膜修復(fù)等過程。當(dāng)海水酸化程度較輕時(shí)（△pH≥-0.3），光棘球海膽可通過上調(diào)腸組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行適應(yīng)和修復(fù)；而當(dāng)海水酸化程度不斷加深時(shí)（△pH≤-0.4）、腸組織中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)受到嚴(yán)重抑制。而對(duì)于海水酸化造成的腸組織損傷，光棘球海膽可能通過其他途徑進(jìn)行修復(fù)，但其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。管足不僅是海膽的感覺、運(yùn)動(dòng)和依附器官，也是海膽感知外界環(huán)境變化或刺激并作出快速反應(yīng)的重要防御器官［37］。目前，尚未有研究報(bào)道海膽管足中TGF-β基因在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫過程中的作用。本研究結(jié)果顯示，海水酸化脅迫下，光棘球海膽管足中MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量隨著酸化時(shí)間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。而當(dāng)海水pH降低0.3和0.4個(gè)單位時(shí)，在光棘球海膽管足中的MnTGF-β基因則在酸化脅迫的第7天出現(xiàn)極顯著的上調(diào)表達(dá)（P＜0.01）。推測(cè)，在酸化脅迫下，管足通過提高其TGF-β基因的相對(duì)表達(dá)量以響應(yīng)外界環(huán)境的變化或刺激，進(jìn)而發(fā)揮防御作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次獲得光棘球海膽的TGF-β基因全長cDNA序列，并對(duì)其序列特征進(jìn)行了較為全面的生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光棘球海膽MnTGF-β與紫球海膽SpTGF-β2的親緣關(guān)系最近，與仿刺參AjTGF-β2可能起源于TGF-β家族的不同亞基?；虮磉_(dá)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，光棘球海膽MnTGF-β基因的相對(duì)表達(dá)具有鮮明的組織特異性。不同海水酸化脅迫條件下，光棘球海膽不同組織中MnTGF-β基因的表達(dá)變化規(guī)律各不相同，呈現(xiàn)一定的組織特異性，說明光棘球海膽MnTGF-β基因在光棘球海膽響應(yīng)海水酸化中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究和探索。