杜婧 李勇 高金榮 劉建國 李晶 魏升升

干眼癥，又稱角結(jié)膜干燥癥，是一種由多種因素引起的淚液和眼表疾病，主要表現(xiàn)為由淚液質(zhì)和量或動力學(xué)異常引起的淚膜穩(wěn)定性下降和眼表損害，伴有眼部干澀、紅腫、異物感等眼表不適和視力障礙[1]。干眼癥多發(fā)于60歲以上的女性，其病因和臨床表現(xiàn)各異，發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前臨床上主要應(yīng)用淚液替代品緩解患者干眼癥狀，但均不能有效根治干眼癥[2]。炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、性激素水平變化等均與干眼癥的發(fā)生相關(guān)，其中炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是干眼癥發(fā)病機(jī)制中最為重要的因素[3-4]。

白介素-1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，具有介導(dǎo)Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)和IL-1信號通路的作用，這些信號通路對調(diào)控免疫應(yīng)答和炎癥過程至關(guān)重要。IRAK家族成員IRAK4與接頭蛋白MyD88結(jié)合后進(jìn)一步吸引IRAK1結(jié)合至該復(fù)合體上，IRAK1被IRAK4磷酸化后高度活化，從該復(fù)合體上解離，結(jié)合并促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF6磷酸化，進(jìn)而活化下游NF-κB、MAPK等信號通路[5]。本研究探討IRAK1和NF-κB在苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥小鼠角膜和結(jié)膜組織中的表達(dá)，為研究干眼癥的炎癥機(jī)制和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組選取6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。裂隙燈顯微鏡下檢查小鼠眼部無異常、淚液分泌量正常。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：清潔、通風(fēng)、溫度為23 ℃±1 ℃，相對濕度為45%±5%，12 h晝/夜交替，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。將小鼠分為對照組(15只)和干眼癥模型組(45只)。對照組小鼠不做處理，干眼癥模型組小鼠用苯扎氯銨誘導(dǎo)建模。

1.1.2主要試劑苯扎氯銨(美國Sigma公司)，淚液檢測酚紅棉線(天津晶明新技術(shù)發(fā)展有限公司)，熒光素鈉注射液(廣西梧州制藥股份有限公司)，抗小鼠IRAK1和NF-κB/p65單克隆抗體(美國Abcam公司)，AlexaFluor?594熒光標(biāo)記二抗、TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司)，F(xiàn)irst Strand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒(日本Takara公司)，PCR引物由西安擎科澤西公司合成。

1.2方法

1.2.1干眼癥小鼠模型建立向干眼癥模型組小鼠雙眼各滴入5 μL 0.75 g·L-1的苯扎氯銨溶液，每天2次，持續(xù)7 d，誘導(dǎo)小鼠干眼模型。實(shí)驗(yàn)開始后1周、2周和4周分別在裂隙燈下觀察并記錄小鼠眼表形態(tài)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對照組小鼠在飼養(yǎng)4周時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2酚紅棉線法測定淚液分泌量給小鼠腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉，使其麻醉固定，輕拉小鼠下眼瞼暴露下結(jié)膜囊，將酚紅棉線一端約1 mm置于下瞼內(nèi)側(cè)1/3結(jié)膜囊內(nèi)，15 s后取出，測量被淚液浸濕的酚紅棉線紅色部分長度，每眼重復(fù)測量3次取平均值并記錄。測試完成后協(xié)助閉合小鼠眼，避免過度暴露及眼表刺激。

1.2.3淚膜破裂時間測量將1 μL 10 g·L-1液態(tài)熒光素鈉滴至小鼠結(jié)膜囊并閉合眼瞼使熒光素鈉均勻涂布于角膜表面，在裂隙燈下通過鈷藍(lán)光觀察，3次瞬目后，以最后1次瞬目后開始計時直至角膜出現(xiàn)第一個黑斑的時間即為淚膜破裂時間(break-up time，BUT)，每眼重復(fù)測3次并計算平均值。

1.2.4角膜和結(jié)膜HE染色造模后1周、2周和4周時，在上述淚液動力學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)束后處死干眼癥模型組小鼠，每個時間點(diǎn)15只小鼠(對照組小鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死)，4只用于HE染色，5只用于免疫熒光染色，6只用于PCR檢測。迅速取下包括上下眼瞼在內(nèi)的整個眼球，40 g·L-1多聚甲醛固定24 h以上，常溫下由低濃度至高濃度梯度酒精脫水各2 h，二甲苯透明后浸蠟、包埋，平行于眼軸方向切片，厚度為3 μm。按照操作說明書進(jìn)行HE常規(guī)染色，染色后脫水透明，最后用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)膜和角膜組織的病理學(xué)變化。

1.2.5免疫熒光染色取新摘取的眼球組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗后用濾紙吸干表面水分，然后將眼球浸沒于OCT包埋劑中并調(diào)整眼球位置，液氮迅速冷凍使其固化，-80 ℃保存?zhèn)溆谩１鶅銮衅瑱C(jī)上以6 μm厚度連續(xù)切片，然后貼附于載玻片上，室溫下干燥約20 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ旧珪r將切片取出晾干后置于冷丙酮中固定10 min。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3次后以體積分?jǐn)?shù)為0.2% 的TritonX-100透膜20 min。PBS再次沖洗后用20 mg·mL-1牛血清白蛋白孵育封閉1 h。棄去封閉液，加入用10 mg·mL-1牛血清白蛋白稀釋的IRAK1(1100)和NF-κB(1100)蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBS浸洗組織切片3次后，加入AlexaFluor?594(1500)熒光標(biāo)記二抗，室溫下避光孵育1 h。PBS浸洗后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6qRT-PCR檢測取新鮮分離的小鼠角膜和結(jié)膜組織剪成細(xì)小的碎片，勻漿后每20 mg組織中加入200 μL TRizol裂解液提取組織總RNA，測得RNA濃度和吸光度比值A(chǔ)260/A280為1.9～2.2。取 1 μg 總RNA利用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其作為PCR擴(kuò)增的模板。以GAPDH作為內(nèi)參，各待測基因引物序列如下：IRAK1，上游引物：5’-GTACCGAGCAGTCATGAGAAATA -3’，下游引物：5’-AGCTGTTCCACCTCTGTTAAG-3’；NF-κB，上游引物：5’-GCTCAAGATCTGCCGAGTAAA-3’，下游引物：5’-GTCCCGTGAAATACACCTCAA-3’；IL-6，上游引物：5’-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3’，下游引物：5’-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3’；IL-1β，上游引物：5’-GAAGAAGAGACGGCTGAGTTT-3’，下游引物：5’-TCACTCTGGTAGGTGTAAGGT-3’；GAPDH，上游引物：5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’，下游引物：5’-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3’。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)；后延伸72 ℃ 10 min。每一個樣品設(shè)置三個重復(fù)，利用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測數(shù)據(jù)，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠淚液分泌的變化干眼癥模型組小鼠造模后1周和2周時，酚紅棉線濕長降低，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；造模4周時，酚紅棉線濕長逐漸恢復(fù)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，干眼癥模型組小鼠BUT在造模后1周和2周增加了1.2～1.3倍，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；而4周時，BUT降低至正常水平，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明苯扎氯銨誘導(dǎo)干眼癥小鼠模型構(gòu)建成功，且在造模后的1周和2周時，干眼癥癥狀最為嚴(yán)重，而后逐漸緩解。見表1。

表1兩組小鼠淚液分泌參數(shù)的變化

指標(biāo)對照組干眼癥模型組1周2周4周酚紅棉線濕長/mm4.03±0.932.80±0.60?2.96±0.46?3.85±0.54BUT/s2.02±0.154.56±0.35?4.67±0.64?2.21±0.19

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2各組小鼠結(jié)膜和角膜HE染色結(jié)果圖1顯示對照組和造模后不同時間點(diǎn)干眼癥模型組結(jié)膜和角膜HE染色結(jié)果?？梢娕c對照組小鼠相比，干眼癥模型組小鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞排列欠整齊，同時伴有缺損；角膜上皮細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核小而扁平；角膜基質(zhì)層膠原纖維排列紊亂、腫脹，成纖維細(xì)胞數(shù)增多且體積增大。對照組角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)膠原纖維排列整齊。

2.3各組小鼠結(jié)膜和角膜組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平干眼癥模型組小鼠結(jié)膜組織IL-6 mRNA表達(dá)水平在造模后2周高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；4周時表達(dá)量比對照組增加了1倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干眼癥模型組小鼠角膜組織中IL-6 mRNA表達(dá)量在造模后2周高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。干眼癥模型組小鼠結(jié)膜組織中IL-1β mRNA在造模后1周和2周均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；4周時下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而角膜組織中IL-1β mRNA在造模后1～4周內(nèi)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4各組小鼠眼部IRAK1表達(dá)和分布免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組小鼠角膜組織中IRAK1主要表達(dá)于角膜基質(zhì)層，上皮層細(xì)胞中IRAK1表達(dá)極微弱。干眼癥模型組小鼠IRAK1在角膜基質(zhì)層的表達(dá)在造模后1周和2周時均明顯增加，同時1周時角膜上皮層IRAK1表達(dá)增加，2周時減少；而在造模后4周時IRAK1在角膜基質(zhì)層和上皮層均僅有微弱表達(dá)(圖2)。同時干眼癥模型組小鼠角膜組織中IRAK1 mRNA的表達(dá)水平在造模后1周和2周時均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，4周時降低；而結(jié)膜組織中IRAK1 mRNA表達(dá)水平在造模后1周和2周時與對照組相比無明顯變化(均為P>0.05)，4周時低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2各組小鼠結(jié)膜和角膜組織中炎癥因子mRNA的表達(dá)水平

炎癥因子對照組干眼癥模型組1周2周4周IL-6 結(jié)膜1.00±0.050.89±0.111.34±0.151.99±0.14? 角膜1.00±0.050.87±0.122.61±0.17△0.98±0.12IL-1β 結(jié)膜1.00±0.061.56±0.12?2.98±0.21△0.89±0.09 角膜1.00±0.071.47±0.15?1.41±0.12?1.50±0.17?

注：與對照組相比，*P<0.05，△P<0.01

圖1 對照組和不同時間點(diǎn)干眼癥模型組小鼠結(jié)膜和角膜HE染色結(jié)果

圖2 對照組和干眼癥模型組小鼠角膜組織IRAK1免疫熒光染色結(jié)果。紅色示IRAK1，藍(lán)色示DAPI

2.5各組小鼠眼部NF-κB的表達(dá)和分布免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組小鼠角膜組織中NF-κB主要表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，在基質(zhì)層中表達(dá)較少。干眼癥模型組小鼠角膜組織中NF-κB在造模后1周和2周時也主要表達(dá)于上皮細(xì)胞中，且NF-κB逐漸發(fā)生核轉(zhuǎn)位，在造模后2周時NF-κB在核中集聚明顯，此時基質(zhì)層中NF-κB也相對增加，而4周時NF-κB的表達(dá)幾乎不可見(圖3)。干眼癥小鼠角膜組織中NF-κB mRNA表達(dá)水平在造模后1周和2周時均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，4周時降低；而結(jié)膜組織中NF-κB mRNA表達(dá)水平僅在造模后2周時高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

圖3 對照組和干眼癥模型組小鼠角膜組織NF-κB免疫熒光染色結(jié)果。紅色示NF-κB，藍(lán)色示DAPI

表3各組小鼠結(jié)膜和角膜組織中IRAK1的mRNA表達(dá)水平

組織對照組干眼癥模型組1周2周4周角膜1.00±0.093.43±0.18△1.71±0.14?1.13±0.12結(jié)膜1.00±0.080.99±0.150.98±0.120.29±0.17?

注：與對照組相比，*P<0.05，△P<0.01

表4各組小鼠結(jié)膜和角膜組織中NF-κBmRNA表達(dá)水平

組織對照組干眼癥模型組1周2周4周角膜1.00±0.063.81±0.18△1.82±0.12?1.44±0.17結(jié)膜1.00±0.081.11±0.152.64±0.18△0.76±0.16

注：與對照組相比，*P<0.05，△P<0.01

3 討論

干眼癥的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，治療手段也無法徹底改變干眼癥慢性、反復(fù)發(fā)作的病程，所以從分子水平上探討干眼癥的發(fā)病機(jī)制將為干眼癥的針對性治療提供依據(jù)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，IRKA1和NF-κB在苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥小鼠角膜和結(jié)膜組織中早期表達(dá)均增加，同時伴隨有炎癥因子水平的升高，證實(shí)IRKA1和NF-κB可能參與干眼癥發(fā)生和發(fā)展過程。

目前建立干眼癥動物模型的方法包括：營養(yǎng)因素剝奪、環(huán)境因素干擾、毒性物質(zhì)和藥物誘導(dǎo)、改變動物性激素分泌水平以及手術(shù)摘除淚腺等。雖然這些建模方法可以從多方面模擬人體干眼癥的病理過程，但并沒有一種方法能完全反映干眼癥的復(fù)雜機(jī)制和病程[7]。本研究利用0.75 g·L-1苯扎氯銨誘導(dǎo)出蒸發(fā)過快型C57BL/6小鼠干眼癥模型，這是目前應(yīng)用較為廣泛的一種方法。相關(guān)研究顯示，苯扎氯銨滴眼造模方法易造成眼表上皮損傷，適合短期重度干眼癥的造模，同時該方法造成的小鼠干眼癥癥狀類似于人類干眼疾病，且相關(guān)組織病理改變也與人類干眼癥接近，包括淚膜穩(wěn)定性受損、眼表炎癥、角膜上皮細(xì)胞凋亡以及杯狀細(xì)胞丟失和鱗狀上皮化生等[8-9]。

眼表(角膜、結(jié)膜和瞼板腺)和主淚腺構(gòu)成的眼表功能單位對淚膜起主要調(diào)控作用，干眼癥發(fā)生時任何眼表功能單位都有可能受到影響[8]。本研究主要關(guān)注干眼癥小鼠模型角膜和結(jié)膜組織中炎癥相關(guān)分子的表達(dá)變化和潛在作用。IRAK1蛋白結(jié)構(gòu)含有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，一個保守的死亡結(jié)構(gòu)域以及一個長的C末端結(jié)構(gòu)，其中死亡結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)其與接頭分子MyD88的相互作用，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中執(zhí)行重要功能，同時富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)其自身發(fā)生磷酸化、泛素化而降解[10]。IRAK1是最早發(fā)現(xiàn)的IRAK家族成員，最初被認(rèn)為是IL-1信號通路中的重要成員。當(dāng)前研究表明，IRAK1可被磷酸化、泛素化、類泛素化和乙酰化，因修飾不同而功能各異[11]。IRAK與人體多種炎性疾病和免疫缺陷性疾病的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)小鼠干眼癥發(fā)展過程中，IRAK1的表達(dá)在苯扎氯銨造模后2周內(nèi)明顯增加，而在造模后4周時，僅有很微弱的表達(dá)。我們考慮造模后前2周增加的IRAK1參與角膜劇烈的炎癥反應(yīng)，而隨著角膜干眼癥狀的減輕，IRAK1表達(dá)急劇下降，這可能與IRAK1發(fā)生自身降解從而防止過度的炎癥反應(yīng)有關(guān)，這可能是IRAK1調(diào)控炎癥反應(yīng)的一個重要負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。有報道顯示，IRAK1在Sj?gren綜合征患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)降低[12-13]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)IRAK1的早期表達(dá)主要分布于角膜基質(zhì)層中，上皮細(xì)胞中僅少量表達(dá)。角膜基質(zhì)層約占整個角膜厚度的90%，是由基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的一種高度有序排列的致密結(jié)締組織。角膜基質(zhì)細(xì)胞是彌散分布于基質(zhì)層之間的一群間充質(zhì)細(xì)胞來源的靜息細(xì)胞，能通過樹枝狀突起相互連接成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，并高表達(dá)晶狀體球蛋白，活化后可轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，因而在角膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)維持及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[14]。高表達(dá)于角膜基質(zhì)細(xì)胞中IRAK1有可能與角膜基質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥負(fù)反饋調(diào)節(jié)、角膜基質(zhì)重建等過程有關(guān)，但由于角膜基質(zhì)細(xì)胞在干眼癥發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確，IRAK1在基質(zhì)細(xì)胞中執(zhí)行的功能仍需進(jìn)一步探究。

IRAK1參與TLR和IL-1R兩個受體家族的信號級聯(lián)反應(yīng)，IRAK1缺陷則抑制TLR7和TLR9活化后炎癥因子IL-6、IL-12、TNF-α的產(chǎn)生[15]。TLR活化后與MyD88相互作用可直接募集IRAK1、IRAK4、TRAF6形成復(fù)合物，最終引起轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1激活而引起炎癥反應(yīng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB主要表達(dá)于正常角膜上皮細(xì)胞質(zhì)中，而苯扎氯銨造模后的干眼癥小鼠NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移，證實(shí)NF-κB在炎癥反應(yīng)中的重要作用。同時在上皮層也有IRAK1的少量表達(dá)，推測上皮細(xì)胞的NF-κB可能與IRAK1活化誘導(dǎo)有關(guān)。