戴碧純，潘碧垚，張珊珊，莊偉偉，孫紅光

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325000）

1 核酸適配體簡(jiǎn)介

核酸適配體（aptamer）是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得一段小ssDNA或者RNA序列。1990年，Tuerk和Gold[1]第一次從體外隨機(jī)文庫中篩選出對(duì)T4 DNA具有親和力的序列，并創(chuàng)建了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，并將該篩選技術(shù)稱為“SELEX”。Ellington和Szostak等[2]從隨機(jī)序列RNA文庫中分離出可特異性結(jié)合多種有機(jī)染料的RNA序列，將其命名為aptamer。簡(jiǎn)單來講，SELEX過程包括以下幾個(gè)步驟：（1）設(shè)計(jì)、合成隨機(jī)DNA或RNA文庫；（2）與靶分子結(jié)合（通常包括正向篩選和負(fù)向篩選）；（3）靶分子與結(jié)合的aptamer分離；（4）分離得到的核酸適配體經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)富集的核酸庫；（5）經(jīng)8～20輪篩選，核酸文庫富集達(dá)到飽和，對(duì)該文庫進(jìn)行測(cè)序[3]。針對(duì)篩選的靶點(diǎn)不同，篩選技術(shù)包括有蛋白質(zhì)SELEX[4]，Cell-SELEX[3]等。經(jīng)過SELEX技術(shù)獲得的適配體可折疊成特有的構(gòu)象，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)、G-四聚體結(jié)構(gòu)、環(huán)形結(jié)構(gòu)等[5]，可與目標(biāo)靶分子特異性結(jié)合，具有良好的靶標(biāo)識(shí)別能力， 可與傳統(tǒng)的抗體相媲美，又被稱為化學(xué)抗體[3]。與傳統(tǒng)抗體相比，aptamer具有分子質(zhì)量較小，靶標(biāo)廣泛，免疫原性低或無免疫原性，生產(chǎn)成本低，易于化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)。

2 核酸適配體用于胰腺癌早期診斷和治療

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAC）是一種惡性程度很高、診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。胰腺癌缺乏特異性的體征和癥狀，近年來其發(fā)病率和死亡率明顯上升，或?qū)⒊^乳腺癌、前列腺癌和直腸癌，成為繼肺癌之后的第二大癌癥[6]，胰腺癌的手術(shù)切除率較低，5年生存率約為5%[7]。目前臨床上胰腺癌的早期篩查手段主要包括B超、CT、磁共振胰膽管成像（MRCP）、超聲內(nèi)鏡（EUS）和經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影（ERCP）等。CT 是胰腺成像檢查的首選方式，也是術(shù)后評(píng)估胰腺癌復(fù)發(fā)的首選方法。然而CT診斷的敏感度隨腫瘤直徑的縮小而降低，且檢查費(fèi)用較高，限制了其作為無癥狀高風(fēng)險(xiǎn)人群的常規(guī)篩查項(xiàng)目[8]。血清腫瘤標(biāo)志物的檢查具有易于收集、創(chuàng)傷小、經(jīng)濟(jì)便捷等優(yōu)點(diǎn)，目前臨床上最常用的胰腺癌早期篩查的腫瘤標(biāo)志物是血清糖抗原（CA19-9），其診斷胰腺癌的總體敏感度79%～81%，特異度80%～90%，但其陽性多見于進(jìn)展期胰腺癌，對(duì)早期小胰腺癌的診斷效能低[9]。由于CA19-9在部分非惡性患者中會(huì)出現(xiàn)假陽性，如急慢性胰腺炎、梗阻性黃疸、肝硬化及胃腸道腫瘤，故主要用于判斷胰腺癌分期、手術(shù)切除效率及檢測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)[10]。目前認(rèn)為單獨(dú)檢測(cè)CA19-9并不適用于早期胰腺癌尤其是小胰腺癌的檢測(cè)及其與良性疾病的鑒別[11]。因此，提高胰腺癌的早期診斷率以及開發(fā)有效的PAC靶向治療方法具有重要意義。

2.1 與胰腺癌細(xì)胞相關(guān)的適配體

癌癥干細(xì)胞（CSCs）具有腫瘤誘導(dǎo)能力，與腫瘤轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)和化療/放射抗性有一定的相關(guān)性[12]。因此，對(duì)CSCs的鑒定可能對(duì)胰腺癌的早期診斷有重要意義。Kim和Song[13]研究了胰腺CSCs相關(guān)適配體作為診斷和治療藥物的新工具。通過改良Cell-SELEX方法，篩選與胰腺癌中癌癥干細(xì)胞結(jié)合的適配體。通過HPAC（胰腺癌細(xì)胞系）產(chǎn)生的tumor sphere進(jìn)行正篩選，然后通過HPDEC（胰腺正常細(xì)胞系）進(jìn)行負(fù)篩選。篩選出高特異性的適配體aptamer 1和aptamer 146，其KD值（平衡解離常數(shù)）分別為22.8 nmol/L和22.62 nmol/L。通過FACS（流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)）分析與適配體陰性細(xì)胞相比，適配體陽性細(xì)胞顯示出高表達(dá)水平的CSCs相關(guān)基因。通過共聚焦顯微鏡在適配體陽性細(xì)胞中也觀察到CD44、CD24、ESA和CD133的共定位。在Kim和Song的研究中，這兩種胰腺CSCs相關(guān)適配體可作為是新的腫瘤診斷標(biāo)志物、CSCs靶向藥物遞送或循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的潛在候選者。

Dua P和Lee DK[14]基于Cell-SELEX篩選出核酸適配體aptamer SQ2，與胰腺癌細(xì)胞表達(dá)的ALPPL2（胎盤堿性磷酸酶蛋白）特異性結(jié)合。經(jīng)修飾后，截短形式的適配體SQ2的長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，KD值為20 nmol/L，在5’和3’兩端進(jìn)行修飾或結(jié)合藥物后不影響其靶向結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)證實(shí)aptamer SQ2可以通過網(wǎng)格蛋白運(yùn)輸或其他細(xì)胞內(nèi)吞途徑內(nèi)化到胰腺癌細(xì)胞中，經(jīng)化學(xué)修飾后可以用于靶向遞送治療性分子。Dua P和Lee DK[14]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)aptamer SQ2可以成功地將抗癌核苷類藥物5F-dU（5-氟-2’-脫氧尿苷）遞送至表達(dá)ALPPL2的胰腺癌細(xì)胞中，但對(duì)正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。

2.2 核酸適配體偶聯(lián)藥物（ApDCs）在胰腺癌治療中的應(yīng)用

吉西他濱（Gemcitabine）為一種新的胞嘧啶核苷衍生物，進(jìn)入人體內(nèi)后由脫氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脫氨酶代謝，是嘧啶類抗腫瘤藥物。其作用機(jī)制和阿糖胞苷相同，主要作用于G1/S期，抑制核苷酸還原酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脫氧核苷三磷酸酯減少，可抑制脫氧胞嘧啶脫氨酶，減少細(xì)胞內(nèi)代謝物的降解，具有自我增效的作用。吉西他濱目前被認(rèn)為是治療胰腺癌的一線化療藥物，具有分子量小，親水性高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也存在反應(yīng)效率低，易被胞苷脫氨酶降解，細(xì)胞滲透性差等缺點(diǎn)。

AS1411是一種富含鳥嘌呤核苷酸的DNA適配體，可以形成G-四鏈體這一獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，使得結(jié)構(gòu)相對(duì)于其他適配體相對(duì)穩(wěn)定。aptamer-AS1411已被證明對(duì)許多癌癥具有抗癌作用。核仁素（nucleolin）是一種細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，通常過表達(dá)于PAC等多種腫瘤細(xì)胞膜及其細(xì)胞質(zhì)中[15]，AS1411可與核仁素特異性結(jié)合，高劑量AS1411與核仁素結(jié)合可以抑制NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[16]。因此，Bates[17]開始對(duì)AS1411進(jìn)行一些臨床研究。然而，AS1411的II期臨床試驗(yàn)結(jié)果不足以成為一線治療藥物。

Park等[18]研究了適配體-藥物偶聯(lián)物（ApDCs），以試圖克服它們的細(xì)胞滲透性差，非特異性毒性等缺點(diǎn)，與抗體偶聯(lián)藥物相比，ApDCs在偶聯(lián)、制劑等方面比抗體有優(yōu)勢(shì)。Ray等[19]首次報(bào)道了將吉西他濱摻入寡核苷酸的概念，通過突變RNA聚合酶將吉西他濱摻入寡核苷酸中，并將含吉西他濱的寡核苷酸進(jìn)行靶向藥物遞送。Park等[18]開發(fā)了一種摻入吉西他濱的AS1411，即APTA-12。吉西他濱是一類可以摻入寡核苷酸的核苷脫氧胞苷類似物，AS1411可形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部莖環(huán)結(jié)構(gòu)位于12-15個(gè)核苷酸之間（序列為5’-GGTGGTGGTGGTTGTGG TGGTGGTGG-3’）。通過用吉西他濱亞磷酰胺單獨(dú)取代AS1411序列14位的鳥嘌呤殘基，產(chǎn)生了APTA-12適配體。APTA-12適配體的序列是5’-GGTGGTGGTG GTTZTGGTGGTGGTGG-3’（Z，吉西他濱）。Park將吉西他濱摻入AS1411適配體的莖環(huán)區(qū)域，以避免改變?nèi)?jí)結(jié)構(gòu)并保護(hù)其免受核酸酶的快速降解。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了APTA-12和AS1411的KD值，分別為（14.37±8.93）nmol/L，和（16.36±10.30）nmol/L。該結(jié)果證明AS1411序列的環(huán)區(qū)域的吉西他濱修飾不改變結(jié)合親和力，并且化學(xué)修飾的APTA-12保留了比AS1411適配體對(duì)核仁蛋白稍高的結(jié)合親和力。

APTA-12在Capan-1，AsPC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞的共聚焦實(shí)驗(yàn)中，選擇性地結(jié)合到細(xì)胞表面，疊層成像顯示內(nèi)化的APTA-12適配體僅在核仁蛋白陽性細(xì)胞中積累。而流式細(xì)胞術(shù)分析表明APTA-12適配體與核仁蛋白的親和力比AS1411更高。此外，APTA-12處理胰腺癌細(xì)胞后顯著降低細(xì)胞增殖，APTA-12處理細(xì)胞的IC50（半抑制濃度）值遠(yuǎn)低于AS1411。體內(nèi)評(píng)價(jià)顯示APTA-12可有效抑制裸鼠胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。與AS1411處理的小鼠相比，APTA-12處理的小鼠的腫瘤區(qū)域中的FDG SUV降低了78%，治療組之間體重沒有明顯差異。TUNEL檢測(cè)和Ki67測(cè)定顯示，與對(duì)照組相比，APTA-12能夠誘導(dǎo)更多的凋亡細(xì)胞死亡并減少增殖的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明摻入吉西他濱的APTA-12的具有抗腫瘤的功效。

Yoon等[20]合成了吉西他濱摻入5-氟尿嘧啶的RNA適配體，并證實(shí)了它可被內(nèi)化并抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖。將溶瘤核苷類似物內(nèi)在地?fù)饺脒m配體被證實(shí)可能是開發(fā)ApDCs的良好策略，因?yàn)槠湟子诨瘜W(xué)修飾同時(shí)不損失親和力，便于大規(guī)?；瘜W(xué)合成，在體內(nèi)比單獨(dú)的藥物具有更高的治療效果，是目前比較有前景的一種抗癌策略。

胰腺癌由于其腫瘤基質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的異常表達(dá)，形成緊密的物理屏障，導(dǎo)致細(xì)胞毒性化學(xué)治療劑難以遞送至腫瘤細(xì)胞中[21]。盡管已經(jīng)開發(fā)了納米藥物，例如脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒和膠束，以增強(qiáng)化學(xué)抗癌劑的滲透性[22]，但治療效果仍不理想。HE[23]基于適配體GBI-10設(shè)計(jì)了具有腫瘤穿透和智能藥物釋放曲線的Apt/CPP-CPTD NP（適配體/細(xì)胞穿透肽-喜樹堿前藥）。GBI-10適配體靶向ECM，被修飾到可滲透細(xì)胞的穿透肽（CPP）上，用于體內(nèi)CPP偽裝和PDAC歸巢，增強(qiáng)了PDAC靶向藥物遞送，并且降低了藥物的全身毒性。

3 核酸適配體在胰腺癌應(yīng)用中面臨的問題及展望

核酸適配體的發(fā)展為腫瘤的診斷和腫瘤靶向治療提供了一種新的方法，與現(xiàn)有的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢查相比，針對(duì)胰腺腫瘤標(biāo)志物篩選出的核酸適配體兼具敏感性和特異性，再結(jié)合影像學(xué)檢查結(jié)果，對(duì)提高胰腺癌早期診斷有一定的幫助。核酸適配體具有良好的組織穿透能力，易被細(xì)胞內(nèi)化，與胰腺癌治療藥物偶聯(lián)可靶向腫瘤特定位點(diǎn)，起到靶向治療的作用，降低一些化學(xué)藥物的全身毒性。靶向PAC 細(xì)胞的適配體還可以被開發(fā)成傳感器，用于快速、高效和更加靈敏地檢測(cè)PAC。

但核酸適配體還存在著一些問題：（1）適配體在體內(nèi)穩(wěn)定性較差，體外篩選得到的適配體在體內(nèi)易被核酸酶降解[24]；（2）適配體相對(duì)分子質(zhì)量小，易被腎臟快速過濾。由于這些缺點(diǎn)，限制了核酸適配體在PAC的臨床應(yīng)用。為了推動(dòng)適配體在PAC臨床應(yīng)用的發(fā)展，主要可從以下幾個(gè)方面來解決上述問題：（1）通過化學(xué)修飾，添加2’-氟、2’-氨基、或2’-O-甲氧[25]，提高核酸適配體的核酸酶抗性；（2）篩選具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的適配體，如G-四聚體以提高生理環(huán)境中的核酸適配體的穩(wěn)定性；（3）與大分子生物材料偶聯(lián)可以解決核酸適配體易被腎臟過濾清除的問題，如偶聯(lián)納米材料[26]。上述修飾或改構(gòu)方法均可顯著提高核酸適配體在體內(nèi)應(yīng)用的有效性，隨著研究的深入，核酸適配體有望應(yīng)用于胰腺癌早期診斷和/或靶向治療，為這一難治性腫瘤的臨床診斷和治療提供新的思路。