陳文鳳，王紅芳，劉振國(guó)，張衛(wèi)星，郗學(xué)鵬，胥保華

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中華蜜蜂Apidaecin的重組表達(dá)及其抗菌活性

陳文鳳，王紅芳，劉振國(guó)，張衛(wèi)星，郗學(xué)鵬，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

【目的】研究中華蜜蜂（）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢桿菌（）中的重組表達(dá)，并驗(yàn)證純化后的重組抗菌肽Apidaecin在體內(nèi)和體外是否具有抗菌活性，為開發(fā)新型、安全具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能的抗菌肽制劑提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳砸獯罄鄯洌ǎ〢pidaecin為模板，克隆出中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，成功構(gòu)建his-pHT43/Apidaecin表達(dá)載體，并參照MoBiTec所提供的制備方法成功制得枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證其活性并得以在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)。使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）進(jìn)行表達(dá)蛋白的分離純化，使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）試劑盒測(cè)定濃度。純化得到的重組抗菌肽Apidaecin作用于大腸桿菌K88，在體外進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)和最小濃度抑菌法測(cè)定；在體內(nèi)，以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型，試驗(yàn)組小鼠腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin，陰性對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注射相同體積的頭孢霉素，然后人為感染大腸桿菌K88，感染24 h后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，取得腸道樣品和血液樣品，并從腸道屏障和免疫功能兩個(gè)方面探討重組抗菌肽Apidaecin對(duì)感染大腸桿菌K88小鼠的保護(hù)作用。使用ELISA試劑盒對(duì)染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）與腸道sIgA水平進(jìn)行測(cè)定，采用qRT-PCR法對(duì)小鼠腸道緊密連接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠腸道細(xì)胞因子（促炎因子TNF-、IFN-、IL6和抑炎因子IL10）的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】克隆得到的中華蜜蜂含有183 bp的堿基，編碼60個(gè)氨基酸，包含Apidaecin的信號(hào)肽序列、一個(gè)基礎(chǔ)的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（內(nèi)含高度保守的8個(gè)氨基酸序列），編碼的蛋白質(zhì)命名為AccApidaecin，其分子量為15.6 kD，等電點(diǎn)為5.33。在IPTG終濃度為3 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，可從1 L表達(dá)上清中純化得到約20 mg抗菌肽。藥敏試驗(yàn)顯示，重組抗菌肽Apidaecin在體外與陰性對(duì)照相比有明顯抑菌圈出現(xiàn)，且測(cè)得的最小抑菌濃度為10 mg·L-1；在小鼠體內(nèi)，腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin的染菌試驗(yàn)組與注射生理鹽水的染菌試驗(yàn)組相比免疫球蛋白含量差異顯著(＜0.05)，說(shuō)明腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin能夠有效緩解由大腸桿菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加；同時(shí)，小鼠腸道相關(guān)蛋白的基因表達(dá)量也差異顯著(＜0.05)，說(shuō)明重組抗菌肽Apidaecin能夠有效保護(hù)被大腸桿菌K88侵染的小鼠腸道?！窘Y(jié)論】在枯草芽孢桿菌中能夠成功重組表達(dá)中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，并且純化后的中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin在體外對(duì)大腸桿菌K88有良好的抗菌效果；經(jīng)腹腔注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，能夠提高小鼠的免疫機(jī)能，有效抵抗大腸桿菌K88對(duì)小鼠的侵染。

中華蜜蜂；抗菌肽；重組表達(dá)；大腸桿菌；抗菌活性

0 引言

【研究意義】抗生素對(duì)于人類的健康和社會(huì)的發(fā)展具有重要作用，但目前抗生素濫用現(xiàn)象已引起國(guó)內(nèi)外的密切關(guān)注，并且抗菌藥物的耐藥性已被視為全球最危害公眾健康的問(wèn)題之一。為了應(yīng)對(duì)耐藥性菌株感染，研究者一方面在對(duì)傳統(tǒng)抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造降低病原菌耐藥性，提高藥物療效，另一方面也在不斷研究和開發(fā)新型抗菌藥物。自第一個(gè)昆蟲源的抗菌肽報(bào)道以來(lái)，抗菌肽作為一種潛在的替代藥物立即引起了人們的高度關(guān)注。蜜蜂是各種作物的有效傳粉者，對(duì)農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境中都具有至關(guān)重要的作用，同時(shí)蜜蜂也經(jīng)常暴露于各種病原體的脅迫環(huán)境中。在長(zhǎng)期與外來(lái)病原物作斗爭(zhēng)的過(guò)程中，蜜蜂形成了與之相對(duì)應(yīng)的分子進(jìn)化策略，發(fā)展出反應(yīng)靈敏且高表達(dá)的Apidaecin抗菌肽基因家族以及其他抗菌肽家族，由于其具有天然的抗菌活性，有望成為抗生素的替代品。從天然組織中分離抗菌肽工作量大，難度高，且獲得的量很少；化學(xué)合成雖然能提供大量的抗菌肽，但價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足研究和潛在應(yīng)用的需求。隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，使大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽并降低生產(chǎn)成本具備了可行性，因此探索適合的基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出大量具有活性的抗菌肽具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在過(guò)去幾十年的研究中，人們對(duì)大腸桿菌（）系統(tǒng)的遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面有了充分的認(rèn)識(shí)，使之成為許多外源蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳圖譜明確，易培養(yǎng)、周期短、費(fèi)用低[1]，對(duì)許多蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的耐受能力，能較高水平地表達(dá)多種蛋白[2]，所以成為應(yīng)用于DNA重組技術(shù)的主要宿主細(xì)菌。然而抗菌肽的抗菌特性使得它們對(duì)宿主菌具有潛在的致命毒性，這成為抗菌肽在大腸桿菌中重組表達(dá)面臨的巨大挑戰(zhàn)。酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾和分泌能力，并且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌[3]，但發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌（）屬于芽孢桿菌屬，是一類好氧型、內(nèi)生抗逆性孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)于飼用抗菌制劑的開發(fā)，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)擁有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比較，枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，是被公認(rèn)的安全微生物，可直接添加于飼料中；與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比較，枯草芽孢桿菌發(fā)酵周期短，操作簡(jiǎn)單，沒(méi)有明顯的密碼子偏好性；枯草芽孢桿菌對(duì)培養(yǎng)基的要求遠(yuǎn)低于酵母，生產(chǎn)成本低[4-6]。此外，枯草芽孢桿菌是豬等動(dòng)物腸道中的一種益生菌，對(duì)維持動(dòng)物腸道健康具有重要作用。同時(shí)蛋白酶缺陷型菌株的構(gòu)建提高了目的蛋白的表達(dá)水平，新型載體的設(shè)計(jì)提高了質(zhì)粒的穩(wěn)定性等[7]。因此，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)適于大多數(shù)飼用抗菌肽的重組表達(dá)。蜜蜂抗菌肽是蜜蜂在受到病原物感染后，其脂肪體迅速合成的一些具有抗菌活性的肽類，然后釋放到血淋巴中發(fā)揮抑制細(xì)菌、真菌、病毒的作用[8]。蜜蜂抗菌肽屬于先天免疫，在體液內(nèi)有4個(gè)基因家族：Apidaecin[9]、Abaecin[10]、Hymenoptaecin[11]、Defensin[12]。其中，Apidaecin是蜜蜂體液中最早被研究的一種抗菌肽，主要對(duì)革蘭氏陰性菌起作用。另外，獨(dú)特的前體結(jié)構(gòu)使受到極少量的病原物刺激后即迅速表達(dá)[9]。并且自然界中的野生中華蜜蜂（）種群由于一直受到相對(duì)較強(qiáng)的環(huán)境選擇壓力，從而保持了中華蜜蜂原有的抗菌肽基因的多樣性，長(zhǎng)期的家養(yǎng)馴化使得意大利蜜蜂（）抗菌肽基因退化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】抗菌肽作為昆蟲體液免疫系統(tǒng)的重要成分，為昆蟲抵御病原物的侵襲建立了堅(jiān)固的屏障。但目前有關(guān)蜜蜂抗菌肽的研究報(bào)道幾乎都集中于意大利蜜蜂，中華蜜蜂的相關(guān)報(bào)道很少，其中對(duì)于中華蜜蜂重組抗菌肽抗菌活性的研究更少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)基因工程技術(shù)，利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，并對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)和體外抗菌活性的驗(yàn)證，為開發(fā)新型、安全具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能的抗菌肽制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院完成。

1.1 材料

供試?yán)ハx：中華蜜蜂取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)蜂群。供試小鼠為屏障環(huán)境SPF級(jí)KM小鼠。

主要試劑：總RNA提取試劑盒（Trizol）、大腸桿菌感受態(tài)DH5購(gòu)自北京全式金公司；原核表達(dá)載體Pet-30a(+)由筆者實(shí)驗(yàn)室提供；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DNA marker DL2000）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR Green Ⅱ定量試劑均購(gòu)自日本Takara公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、dNTP、LA-Taq DNA聚合酶及凝膠回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)PUEX公司；枯草芽孢桿菌WB800N以及枯草芽孢桿菌表達(dá)載體his-pHT43購(gòu)自于淼靈質(zhì)粒平臺(tái)（http://www.miaolingbio.com/）；血清免疫球蛋白試劑盒以及腸道分泌型免疫球蛋白IgA試劑盒購(gòu)自于科諾迪生物；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）購(gòu)自于康為世紀(jì)生物科技有限公司；Easy II Protein Quantitative Kit （BCA）試劑盒購(gòu)自北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 Trizol法提取蜜蜂以及小鼠腸道樣品的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：體系混勻后，42℃反應(yīng)40 min，75℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃。

1.2.2 中華蜜蜂引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序以及誘導(dǎo)表達(dá) 引物設(shè)計(jì)：由于中華蜜蜂和意大利蜜蜂為兩個(gè)親緣關(guān)系最近的物種，同一基因的序列在這兩個(gè)物種間變異很小，因此，根據(jù)GenBank中意大利蜜蜂基因序列（GenBank登錄號(hào)LOC406115），利用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)基因序列引物，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司（簡(jiǎn)稱上海生工）合成。

在PCR擴(kuò)增中，反應(yīng)體系（25 μL）：5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR緩沖液、1 μL dNTP、1 μL模板，上下游引物各1 μL、0.25 μL LA-Taq DNA聚合酶，18.25 μL雙蒸水。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存待測(cè)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并割膠純化，克隆于T1載體內(nèi)，最后將鑒定的陽(yáng)性克隆菌送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

表1 基因引物序列

根據(jù)測(cè)序結(jié)果和比對(duì)結(jié)果，選擇比對(duì)后的特異性序列，然后將含特異性序列的菌液送至上海生工并由其克隆至載體pHT43。

1.2.3 菌株轉(zhuǎn)化、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化以及蛋白濃度測(cè)定 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化以及誘導(dǎo)表達(dá)參見MoBiTec所提供的制備方法（https://www. mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/bacillus_subtilis_expression.html），獲得的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)立即使用，以保證最高的轉(zhuǎn)化效率。在IPTG終濃度為3 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)表達(dá)12 h后進(jìn)行分離純化。收集菌體，超聲破碎，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清，按His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）操作說(shuō)明書進(jìn)行蛋白的純化，并使用BCA蛋白定量方法測(cè)定純化后的蛋白濃度。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 取1 μL cDNA加入到20 μL熒光定量體系中，按照熒光定量試劑盒（TaKaRa）操作指南，用7500 real-time PCR儀（ABI 7500，USA）檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，10 s；變性95℃，5 s；退火60℃40 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線添加，1個(gè)循環(huán)。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來(lái)自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，以為內(nèi)參，采用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托上海生工合成引物，引物序列如表1所示。

1.2.5 小鼠分組與處理 18—20 g體重的雄性小鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；小鼠日糧為小鼠SPF級(jí)大小鼠維持飼料，購(gòu)自華阜康生物有限公司；飼養(yǎng)環(huán)境：屏障系統(tǒng)，溫度控制在22—25℃，相對(duì)濕度40%—60%，黑暗12 h，光照12 h。6組不同處理參考小鼠試驗(yàn)分組（表2），接菌后，取腸道相關(guān)樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6 抑菌圈檢測(cè)重組抗菌肽的抗菌活性 環(huán)劃線接種大腸桿菌于瓊脂平板，37℃生化培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落接種于5 mL新鮮肉湯培養(yǎng)基中，于37℃搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將上述過(guò)夜培養(yǎng)菌懸液50 μL轉(zhuǎn)接至5 mL新鮮肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)2—3 h至吸光值OD600=0.5左右。取100 μL菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，將紙片輕輕放置于涂布好菌液的培養(yǎng)基上，滴加3—4 μL相應(yīng)的液體，設(shè)置陰性（滅菌水）和陽(yáng)性（頭孢霉素）對(duì)照，按照同樣的方法和步驟，設(shè)置4個(gè)重復(fù)的固體培養(yǎng)基，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜，觀察并拍照記錄結(jié)果。

表2 重組抗菌肽Apidaecin對(duì)小鼠感染大腸桿菌K88保護(hù)作用試驗(yàn)分組

菌懸液指OD600=0.5的大腸桿菌K88[13]菌懸液The bacteria suspension refers to theK88 suspension of OD600=0.5

1.2.7 最小抑菌濃度法（MIC）檢測(cè)重組抗菌肽的抗菌活性 將同1.2.6方法培養(yǎng)的OD600=0.5的菌懸液10 μL轉(zhuǎn)接至10 mL新鮮肉湯培養(yǎng)基中，渦旋振蕩混勻；此時(shí)細(xì)菌密度在1×105cfu/mL，用于MIC的測(cè)定。將抗菌肽與抗生素進(jìn)行梯度稀釋，至終濃度為2 560、1 280、640、320、160、40、20、10、5和2.5 μg·mL-1系列濃度稀釋液；向無(wú)菌96孔圓底板中加入90 μL制備好的菌懸液，再逐一加入10 μL相應(yīng)濃度的抗菌肽稀釋液或抗生素稀釋液，待測(cè)終濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1；設(shè)菌懸液為陽(yáng)性對(duì)照孔，肉湯培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，重組抗菌肽和抗生素（頭孢菌素）均設(shè)3次重復(fù)，將96孔板置于37℃生化培養(yǎng)箱中保濕靜置培養(yǎng)18—24 h，培養(yǎng)后觀察各孔底部是否有細(xì)菌沉淀產(chǎn)生，無(wú)肉眼可見細(xì)菌沉淀的最小濃度可判定為該抗菌物質(zhì)的MIC。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析（one- way ANOVA）和Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 中華蜜蜂Apidaecin cDNA的克隆以及序列分析

以中華蜜蜂總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用引物API-F/ API-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條183 bp特異性片段（圖1），通過(guò)ExPASy網(wǎng)站（http://www. expasy.cn）進(jìn)行分析獲得中華蜜蜂，含有183 bp的堿基，編碼60個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)命名為AccApidaecin，其分子量為15.6 kD，等電點(diǎn)為5.33。其氨基酸序列分析如圖2所示。

M：DL 2000 DNA Marker；1—4：基因擴(kuò)增產(chǎn)物Product of genome walking

2.2 AccApidaecin蛋白的純化與分離

在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)了具有活性的AccApidaecin。在IPTG終濃度為3 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)表達(dá)12 h后進(jìn)行分離純化?？咕闹饕植荚诎猓置谛矢?。通過(guò)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）從1 L表達(dá)上清中純化得到了約20 mg抗菌肽，圖3為SDS-PAGE電泳結(jié)果。

2.3 抑菌圈檢測(cè)重組抗菌肽的抗菌活性

將OD600=0.5的K88均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，5個(gè)0.5 cm的紙片上分別滴加3 μL的滅菌雙蒸水、10 mg·L-1重組AccApidaecin、20 mg·L-1的重組AccApidaecin、10 mg·L-1的頭孢霉素和100 mg·L-1的頭孢霉素，涂好的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。結(jié)果如圖4所示，與陰性對(duì)照1號(hào)相比，其余均有明顯抑菌圈出現(xiàn)，表明重組抗菌肽在體外具有良好的抗菌活性。

方框表示AccApidaecin的信號(hào)肽序列；下劃線部分為一個(gè)基礎(chǔ)的RR二肽；橢圓形邊框表示抗菌肽AccApidaecin氨基酸序列，陰影部分為高度保守的8個(gè)氨基酸序列The box indicates signal peptide sequence of AccApidaecin; The underlined part represents a basic RR dipeptide; The oval border represents the amino acid sequence of AccApidaecin, and the shaded part is a highly conservative sequence of 8 amino acids

1：蛋白Marker protein marker；2：誘導(dǎo)表達(dá)的pHT43空載體induced overexpression of pHT43；3：未誘導(dǎo)表達(dá)的pHT43(+)-AccApidaecin non-induced overexpression of pHT43(+)-AccApidaecin；4—8：誘導(dǎo)表達(dá)的pHT43(+)-AccApidaecin Induced overexpression of pHT43(+)- AccApidaecin

2.4 最小濃度抑菌法檢測(cè)重組抗菌肽的抗菌活性

重組抗菌肽AccApidaecin對(duì)K88的最小抑菌濃度為10 mg·L-1，頭孢噻肟（Cafotaxime Na salt）對(duì)K88的最小抑菌濃度為5 mg·L-1。

2.5 重組抗菌肽對(duì)染菌小鼠血清免疫球蛋白含量與腸道sIgA水平的影響

如圖5所示，染菌對(duì)照組免疫球蛋白含量與腸道sIgA水平最高，并與其他各組差異顯著。血清IgA、IgG和IgM水平變化與sIgA—致，表明重組抗菌肽AccApidaecin顯著緩解由于染菌導(dǎo)致的血清和腸道免疫球蛋白含量的升高。

1：滅菌雙蒸水Sterilized double distilled water；2：100 mg·L-1的頭孢霉素Cafotaxime (100 mg·L-1)；3：20 mg·L-1的重組Apidaecin recombinant Apidaecin (20 mg·L-1)；4：10 mg·L-1的頭孢噻肟Cafotaxime (10 mg·L-1)；5：10 mg·L-1重組AccApidaecin Recombinant AccApidaecin (10 mg·L-1)

2.6 重組抗菌肽對(duì)染菌小鼠腸道相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR法對(duì)小鼠腸道緊密連接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠腸道細(xì)胞因子（促炎因子TNF-、IFN-、IL6和抑炎因子IL10）的表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明染菌后TNF-、IL6和IL10表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），而claudin-1、ZO-2和IFN-表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）（圖6-a、6-b）；然而染菌后，注射了重組抗菌肽和頭孢霉素的試驗(yàn)組，都顯著抑制TNF-、IL6和IL10表達(dá)水平的升高以及claudin-1、ZO-2和IFN-表達(dá)水平的降低（＜0.05）（圖6-c、6-d、6-e、6-f）。綜合來(lái)看，重組抗菌肽Apidaecin能夠有效保護(hù)大腸桿菌K88侵染后的小鼠腸道。

NC：正常對(duì)照組Normal control group；API：20 mg·L-1重組Apidaecin染菌組20 mg·L-1 Recombinant Apidaecin infection group；K88：染菌對(duì)照組Infection control group；CTX：150 mg·L-1頭孢噻肟染菌組150 mg·L-1Cefotaxime infection group。圖6同The same as Fig. 6

3 討論

Casteels-Josson等[14]分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)Apidaecin前體蛋白可加工生產(chǎn)最多可達(dá)12個(gè)Apidaecin的單元，即有重復(fù)單元的現(xiàn)象，導(dǎo)致的直接結(jié)果是可以迅速地增強(qiáng)昆蟲本身的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生超量的蜜蜂肽。具有生物活性的Apidaecin是由兩個(gè)加工序列EAEPEAEP（變異體）和RR連接在一起的。如圖2所示，對(duì)克隆得到的序列進(jìn)行分析，GNNRPVYIPQPRPPHPRI是Apidaecin的18個(gè)氨基酸序列，Apidaecin是富含脯氨酸的短肽，在C端具有高度保守的8個(gè)氨基酸（PRPPHPRL/I），而它們的N-末端是可變區(qū)，與其抗菌活性息息相關(guān)。目前，抗菌肽已在很多表達(dá)系統(tǒng)運(yùn)用各種表達(dá)策略成功表達(dá)，例如大腸桿菌中的融合表達(dá)[15-17]和雜合表達(dá)[18-20]、畢赤酵母菌表達(dá)系統(tǒng)[21]、乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)[22]等，但對(duì)于重組抗菌肽的抗菌活性并沒(méi)有進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。

Apidaecin對(duì)革蘭氏陰性菌效果顯著，與細(xì)菌表面結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，最后與靶蛋白結(jié)合（主要是熱休克蛋白DnaK）。由于這種靶向特異性，Apidaecin對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是無(wú)毒的和非溶血的，因此被認(rèn)為是新的抗生素候選藥物[23]。本研究以大腸桿菌K88作為致病原對(duì)重組抗菌肽體外抗菌活性以及小鼠的體內(nèi)抗菌活性進(jìn)行驗(yàn)證，抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明重組抗菌肽Apidaecin在體外具有良好的抗菌活性，重組抗菌肽Apidaecin對(duì)大腸桿菌K88的最小抑菌濃度為10 mg·L-1。

圖6 重組抗菌肽對(duì)染菌小鼠腸道相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響

重組抗菌肽Apidaecin在體外具有良好的抗菌活性，但體內(nèi)環(huán)境遠(yuǎn)比體外環(huán)境復(fù)雜。體內(nèi)pH、離子強(qiáng)度以及宿主的蛋白酶等都會(huì)對(duì)抗菌肽造成影響。因此，本試驗(yàn)在獲得重組抗菌肽的基礎(chǔ)上，以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型，從腸道屏障和免疫功能兩個(gè)方面探討重組抗菌肽Apidaecin對(duì)感染大腸桿菌K88小鼠的保護(hù)作用。緊密連接是腸黏膜機(jī)械屏障的重要組成部分，主要由跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白組成，其中跨膜蛋白包括occludin、claudin-1、連接黏附分子等；胞質(zhì)蛋白主要為ZO家族，與緊密連接結(jié)構(gòu)的其他蛋白以及細(xì)胞骨架相連。緊密連接具有物質(zhì)大小和電荷選擇性，是決定腸道通透性的關(guān)鍵因素，維持緊密連接形態(tài)和功能的完整性對(duì)保護(hù)腸黏膜屏障、防止細(xì)菌移位有著重要意義[24]。小鼠腸道細(xì)胞因子（促炎因子和抑炎因子）平衡失調(diào)被認(rèn)為是腸道炎癥性疾病的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞因子異常表達(dá)與結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[25]。本試驗(yàn)采用qRT-PCR法對(duì)小鼠腸道緊密連接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠腸道細(xì)胞因子（促炎因子TNF-、IFN-、IL6和抑炎因子IL10）的表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K88侵染小鼠后，導(dǎo)致claudin-1、ZO-2和IFN-表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組，而TNF-、IL6和IL10表達(dá)水平顯著升高，與齊珂珂等[26]的研究相一致。而腹腔注射重組抗菌肽Apidaecin以及頭孢霉素皆可以有效抵御大腸桿菌K88侵染小鼠帶來(lái)的一系列炎癥反應(yīng)，表明重組抗菌肽Apidaecin 能夠有效保護(hù)大腸桿菌K88侵染后的小鼠腸道。

本試驗(yàn)還檢測(cè)了血清中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）以及腸道中sIgA的含量，結(jié)果顯示染菌組顯著高于正常對(duì)照組，與之前余樹培[27]報(bào)道的大腸桿菌K88可導(dǎo)致小鼠腹瀉相符，表明大腸桿菌K88可導(dǎo)致小鼠染病并激起機(jī)體的免疫應(yīng)答。空載體正常組與染菌組相比差異不明顯，而重組抗菌肽Apidaecin以及頭孢霉素的正常組與染菌組相比差異顯著，這幾種免疫球蛋白或細(xì)胞因子的水平在一定程度上反應(yīng)了免疫功能[27-29]，表明腹腔注射的重組抗菌肽Apidaecin能提高小鼠的免疫機(jī)能，從而抵抗大腸桿菌K88對(duì)小鼠的侵染。

目前，關(guān)于抗菌肽的抗菌機(jī)制有眾多的猜想，但是抗菌肽抗菌機(jī)制研究只針對(duì)了個(gè)別幾種，所以還沒(méi)有一個(gè)能夠涵蓋所有種類抗菌肽作用機(jī)理的假說(shuō)，而且也不確定哪種假說(shuō)更接近真實(shí)情況[30]。常見的抗菌肽作用機(jī)制有桶板模型[31]、毯式模型[32]、環(huán)形孔模型[33]、凝聚模型以及其他作用機(jī)制[34]。對(duì)于重組抗菌肽Apidaecin的抗菌機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在枯草芽孢桿菌中成功重組表達(dá)得到了中華蜜蜂抗菌肽Apidaecin，其在體內(nèi)/體外均對(duì)大腸桿菌K88有良好的抗菌效果，并且能夠提高小鼠的免疫機(jī)能，抵抗大腸桿菌K88對(duì)小鼠的侵染。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Recombinant expression and antimicrobial activity of Apidaecin in

CHEN WenFeng, WANG HongFang, LIU ZhenGuo, ZHANG WeiXing, CHI XuePeng, XU BaoHua

(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong)

【Objective】In order to study the recombinant expression of antimicrobial peptide apidaecin ofin, verify whether the purified recombinant antimicrobial peptide Apidaecin has antibacterial activityandor not, and to provide a theoretical basis for the development of new antimicrobial peptide preparations with safe antibacterial and immunomodulatory functions.【Method】The experiment usedApidaecin inas templates to clone the antimicrobial peptide Apidaecin in, and his-pHT43/Apidaecin expression vector was successfully constructed. In addition, the competentcells were successfully prepared according to the method provided by MoBiTec. The cells were prepared and used on demand to ensure the activity. Protein was isolated and purified using 6×His-Tagged Protein Purification Kit (soluble protein), and the Easy II Protein Quantitative Kit (BCA) was used for concentration determination. The purified recombinant antimicrobial peptide Apidaecin acted onK88. The disk diffusion test and minimum inhibitory concentration (MIC) were conducted., mice were used as experimental animal models, mice in the experimental group were injected with recombinant antibacterial peptide Apidaecin by intraperitoneal injection, mice in the negative control group were injected with normal saline of the same volume, and the positive control group was injected with the same volume of cefotaxime, then artificially infected withK88. After 24 hours of infection, the mice were dissected, intestinal samples and blood samples were obtained, and the protective effect of Apidaecin on the mice infected withK88 was discussed from the perspective of intestinal barrier and immune function. Serum immunoglobulin (IgA, IgG, IgM) and intestinal sIgA levels were determined by using ELISA kit in the experiment. In addition, the expression levels of intestinal tightly-connected protein genes (claudin-1, ZO-2) and intestinal cytokines (proinflammatory cytokines TNF-, IFN-, IL6 and anti-inflammatory factor IL10) were determined by qRT-pcr. 【Result】Theinwas cloned, containing 183 bp, encoding 60 amino acids, including signal peptide sequence of Apidaecin, a basic RR dipeptide and amino acid sequence of Apidaecin (containing 8 highly conserved amino acid sequences). The protein encoded is named AccApidaecin, its molecular weight is 15.6 kD and isoelectric point is 5.33. About 20 mg antimicrobial peptides could be purified from 1 L supernatant at the concentration of IPTG was 3 mmol·L-1, induction temperature was 30℃, and inducing time was 12 h. The recombinant antibacterial peptide Apidaecin showed obvious antibacterial ringcompared with the negative control, and the measured MIC was 10 mg·L-1. In mice, there were significant differences in immunoglobulin between the bacterial test group injected with recombinant antimicrobial peptide apidaecin by intraperitoneal injection and the bacterial test group injected with saline (＜0.05), which indicated that recombinant Apidaecin could effectively alleviate the increase of immunoglobulin content in mice caused byK88. The gene expression level of intestinal related proteins in mice was also significantly different (＜0.05), which indicated that the recombinant Apidaecin could effectively protect the intestinal tract of mice infected withK88.【Conclusion】The antimicrobial peptide apidaecin inwas successfully expressed in. The purified antibacterial peptide apidaecin inhas a good antibacterial effect onK88. In addition, it can be injected into mice through abdominal cavity to improve the immune function of mice and effectively resist the infection ofK88 to mice.

; antimicrobial peptide; recombinant expression;; antimicrobial activity

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.04.016

2018-09-04；

2018-10-09

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-44）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31572470）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程（南種北繁）（2017LZN006）

陳文鳳，E-mail：269099781@qq.com。通信作者胥保華，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn